2022-07-19
概要
有效的(de)(de)顆(ke)粒監測策(ce)略對于(yu)安全生(sheng)物制劑的(de)(de)開發和生(sheng)產至關(guan)重(zhong)要，因為(wei)這些顆(ke)粒可以極大地影(ying)響患者的(de)(de)治 療結果。 流(liu)式成(cheng)像顯微鏡(FIM)是一(yi)種備(bei)受關(guan)注的(de)(de)技術，用(yong)于(yu)確定(ding)生(sheng)物治 療樣品(pin)中直徑2 - 100 μm的(de)(de)亞可見顆(ke)粒的(de)(de)數(shu)量、大小和類(lei)型。
FlowCam Nano將這(zhe)種分(fen)析擴展到更(geng)小的亞(ya)(ya)可見和亞(ya)(ya)微(wei)米顆(ke)粒(直徑為300 nm - 2 μm的顆(ke)粒)，這(zhe)是傳(chuan)統的FIM儀器無(wu)法有效成像的粒度(du)范圍(wei)。 亞(ya)(ya)微(wei)米FIM允(yun)許用戶檢(jian)測(ce)顆(ke)粒源，如API聚集和細菌(jun)污(wu)染，最初(chu)產生(sheng)的顆(ke)粒太小，無(wu)法通過傳(chuan)統成像技術檢(jian)測(ce)，但如果不解決(jue)，可能會聚集成更(geng)大的亞(ya)(ya)可見顆(ke)粒。
在本研究中，我們(men)通過使用傳統的亞可見和(he)亞微(wei)米FIM分(fen)析(xi)含有蛋白質(zhi)聚集體、蔗糖聚集體和(he)大腸桿(gan)菌細胞的溶液，展示了FlowCam Nano在生物治 療(liao)開發中的應(ying)用。 對于每(mei)種(zhong)樣品類型，FlowCam Nano提供(gong)了顆(ke)粒大小和(he)形狀(zhuang)信息。
在一項同時進(jin)行的研(yan)究中，兩(liang)臺FlowCamNano也(ye)被用(yong)來證明其準確檢測細(xi)(xi)菌相(xiang)對顆粒(li)濃(nong)度的能(neng)力。 這些研(yan)究表明，FlowCam Nano可(ke)以可(ke)靠地檢測聚集的顆粒(li)源和細(xi)(xi)菌污染(ran)，而(er)且可(ke)能(neng)比傳統的FIM應用(yong)于(yu)更早期的檢測。
介紹
所有(you)生物(wu)(wu)(wu)制劑(ji)都(dou)含有(you)顆(ke)粒(li)(li)。 顆(ke)粒(li)(li)可以有(you)各種來(lai)源(yuan)，如活性藥(yao)物(wu)(wu)(wu)成(cheng)分(API)及其聚集物(wu)(wu)(wu)，容(rong)器封閉系統(如硅油滴(di)，玻(bo)璃碎屑)，上(shang)游處理步(bu)驟的(de)(de)污染物(wu)(wu)(wu)，以及其他(ta)來(lai)源(yuan)。 雖然這些微粒(li)(li)可以是蛋(dan)白(bai)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)活性成(cheng)分(例(li)如，細胞藥(yao)物(wu)(wu)(wu)產(chan)品中(zhong)的(de)(de)細胞，藥(yao)物(wu)(wu)(wu)輸送載體(ti))，但它們通(tong)常是雜質(zhi)，可能會顯著(zhu)降低治(zhi) 療(liao)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)的(de)(de)療(liao) 效(xiao)。 建議研究人員在其生物(wu)(wu)(wu)治(zhi) 療(liao)藥(yao)物(wu)(wu)(wu)中(zhong)對(dui)顆(ke)粒(li)(li)進行(xing)特征描(miao)述(shu)，不僅要滿足(zu)諸如USP <788>等法規，而且要確定和控制顆(ke)粒(li)(li)形成(cheng)的(de)(de)來(lai)源(yuan)，并最 大(da)限度地提(ti)高其治(zhi) 療(liao)的(de)(de)安全性和有(you)效(xiao)性。 因(yin)此，新的(de)(de)、更靈敏的(de)(de)技術對(dui)于確保這些治(zhi) 療(liao)的(de)(de)安全性至關重要。
流(liu)動成像(xiang)顯微(wei)鏡(FIM)是一(yi)種日益流(liu)行的技(ji)術(shu)，用(yong)于分(fen)(fen)析(xi)生物(wu)治 療(liao)中的微(wei)粒(li)。 像(xiang)FlowCam這(zhe)樣(yang)的FIM儀器結合了微(wei)流(liu)體和光學顯微(wei)鏡技(ji)術(shu)，可以快(kuai)速、大量地自動捕(bu)捉圖像(xiang)。 這(zhe)些圖像(xiang)可以用(yong)來分(fen)(fen)析(xi)生物(wu)治 療(liao)樣(yang)品中顆粒(li)的濃度、大小分(fen)(fen)布和形態。 然(ran)后，用(yong)戶(hu)可以將這(zhe)些信息(xi)與(yu)正交技(ji)術(shu)的信息(xi)一(yi)起分(fen)(fen)析(xi)，從而對(dui)樣(yang)本質量進行有用(yong)的全面評(ping)估。
典(dian)型的(de)(de)(de)(de)(de)FIM儀器被設計用(yong)(yong)于(yu)分(fen)析直徑大于(yu)2 μm的(de)(de)(de)(de)(de)亞可見顆(ke)粒(li)(li)(見圖1和(he)表1)。這些亞可見顆(ke)粒(li)(li)受到(dao)了(le)研究人員的(de)(de)(de)(de)(de)廣泛(fan)關注，然(ran)而人們對分(fen)析生物制藥中傳統成(cheng)像技術(shu)(shu)尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)范(fan)圍之外的(de)(de)(de)(de)(de)更(geng)(geng)小的(de)(de)(de)(de)(de)亞微米顆(ke)粒(li)(li)(即100 nm到(dao)1 μm之間(jian)的(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li))越來越感興趣。 雖然(ran)這些顆(ke)粒(li)(li)不(bu)直接(jie)受USP <787/788>等規則的(de)(de)(de)(de)(de)約束，但在這個尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)范(fan)圍內的(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)可以(yi)聚(ju)(ju)集或(huo)以(yi)其他方式促進(jin)更(geng)(geng)大的(de)(de)(de)(de)(de)亞可見顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)形成(cheng)，因而會(hui)相(xiang)關顆(ke)相(xiang)關粒(li)(li)法規規則的(de)(de)(de)(de)(de)監管。 像FIM這樣用(yong)(yong)于(yu)分(fen)析這些亞微米顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)技術(shu)(shu)將使得用(yong)(yong)戶能(neng)(neng)夠在進(jin)一步團聚(ju)(ju)發生之前及(ji)早檢測顆(ke)粒(li)(li)產(chan)生的(de)(de)(de)(de)(de)來源，如蛋白質和(he)蔗糖的(de)(de)(de)(de)(de)聚(ju)(ju)集。 此外，一些顆(ke)粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)(de)尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)分(fen)布較窄，接(jie)近或(huo)低于(yu)典(dian)型FIM儀器的(de)(de)(de)(de)(de)尺(chi)(chi)寸(cun)(cun)范(fan)圍(如細(xi)菌細(xi)胞、一些藥物傳遞載(zai)體)，需(xu)要亞微米聚(ju)(ju)焦方法才能(neng)(neng)被檢測。
圖1:FlowCam Nano和FlowCam 8000系列儀器的尺寸范圍
FlowCam Nano是(shi)(shi)近年來引入的(de)(de)(de)(de)一(yi)種(zhong)用(yong)(yong)(yong)于(yu)檢(jian)測和分析亞(ya)微(wei)(wei)(wei)米(mi)顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)新型顆(ke)粒(li)分析技(ji)術。 該儀(yi)(yi)器(qi)(qi)采用(yong)(yong)(yong)了FIM的(de)(de)(de)(de) 專 利改造，采用(yong)(yong)(yong)了基(ji)于(yu)油浸的(de)(de)(de)(de)光學(xue)顯微(wei)(wei)(wei)鏡(jing)系統(tong)(tong)(tong)，使用(yong)(yong)(yong)40倍物鏡(jing)來捕(bu)獲顆(ke)粒(li)圖像(xiang)(圖2)。這(zhe)(zhe)使得該儀(yi)(yi)器(qi)(qi)能夠檢(jian)測到(dao)300 nm到(dao)2 μm之間的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)，這(zhe)(zhe)是(shi)(shi)光學(xue)顯微(wei)(wei)(wei)鏡(jing)可見的(de)(de)(de)(de)最小(xiao)物體。 在這(zhe)(zhe)個尺(chi)寸范圍內(nei)的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)不(bu)僅被傳統(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)流動成像(xiang)顯微(wei)(wei)(wei)鏡(jing)所忽略，而且用(yong)(yong)(yong)其(qi)他的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)分析儀(yi)(yi)器(qi)(qi)也很難(nan)對其(qi)進(jin)行表征，其(qi)中許(xu)多儀(yi)(yi)器(qi)(qi)要(yao)么(me)不(bu)是(shi)(shi)集(ji)成技(ji)術，要(yao)么(me)不(bu)提供形態(tai)信(xin)息(xi)。 像(xiang)傳統(tong)(tong)(tong)的(de)(de)(de)(de)FIM儀(yi)(yi)器(qi)(qi)一(yi)樣(yang)，FlowCam Nano記(ji)錄(lu)每個顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)大小(xiao)和形態(tai)信(xin)息(xi)，這(zhe)(zhe)些信(xin)息(xi)可以用(yong)(yong)(yong)于(yu)識別(bie)樣(yang)品中亞(ya)微(wei)(wei)(wei)米(mi)顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)類型。
該儀器(qi)使用的(de)(de)淺景深(shen)設計(ji)(ji)是為了最 大(da)限度地提(ti)高圖像質量(liang)，從(cong)而(er)從(cong)儀器(qi)中獲(huo)得形態信息。 雖然這種景深(shen)導致一些物(wu)體(ti)不(bu)對焦，從(cong)而(er)無法(fa)檢(jian)(jian)測到，但(dan)儀器(qi)報告的(de)(de)相對顆(ke)(ke)(ke)粒計(ji)(ji)數(shu)樣(yang)品之(zhi)間(jian)是一致的(de)(de)，使得FlowCam Nano也能夠(gou)用于監測相對顆(ke)(ke)(ke)粒水平。 該設備還(huan)可以(yi)在校(xiao)準計(ji)(ji)數(shu)模式下(xia)操作，為包(bao)含深(shen)色、易于檢(jian)(jian)測的(de)(de)物(wu)體(ti)的(de)(de)樣(yang)品提(ti)供精確的(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒計(ji)(ji)數(shu)，類似于聚苯乙烯乳膠校(xiao)準珠。FlowCam Nano還(huan)保(bao)留了典型FIM儀器(qi)的(de)(de)高通(tong)量(liang)和(he)易于使用的(de)(de)優(you)點，允許快速和(he)高效的(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒成像，特(te)別是相對于手動油浸顯微鏡。
表1:不同顆粒尺寸的通用定義。FlowCam 8100和其他FIM儀器專注于亞可見顆粒，FlowCam Nano專注于亞微米顆粒。
為了(le)證明FlowCam Nano在生物治 療開發中的(de)應用，本研究比較了(le)FlowCam 8100檢測到的(de)亞(ya)可見(jian)顆粒和FlowCam Nano檢測到的(de)亞(ya)微米顆粒的(de)大(da)小分布和圖(tu)像(xiang)。 在兩(liang)種(zhong)儀(yi)器上分析了(le)治 療蛋(dan)白(bai)配方中三種(zhong)潛在的(de)雜質:蛋(dan)白(bai)質聚集(ji)體、蔗糖聚集(ji)體和污(wu)染細菌。 我們還使用FlowCam Nano來測量(liang)不同稀釋度下的(de)細菌培養濃度，以(yi)評估儀(yi)器的(de)計數性(xing)能。
圖2:油浸式流動成像顯微鏡示意圖，FlowCam Nano使用該技術對亞微米顆粒進行成像
實驗與方法
材料：牛(niu)血清白蛋白(BSA)粉末、蔗糖和(he)(he)磷酸鹽緩沖(chong)鹽水(PBS)取自Sigma-Aldrich公司(圣路(lu)易(yi)斯(si)，MO)。 大(da)腸桿菌培養物來(lai)自Carolina Biological Supply (Burlington, NC)。 分別用700 nm和(he)(he)15 μm Duke Standards聚(ju)苯(ben)乙烯(xi)微球聚(ju)焦FlowCam Nano和(he)(he)FlowCam 8100。FlowCam Nano的浸泡(pao)油來(lai)自ibidi(菲(fei)希堡，WI)。Micro-90來(lai)自International Products Corp. (Burlington, NJ)。
樣品制備：將(jiang)含(han)有(you)(you)蛋白(bai)質聚(ju)集(ji)物(wu)(wu)、蔗糖(tang)顆粒和(he)大(da)腸桿菌(jun)(jun)(jun)細(xi)胞(bao)的(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)置于PBS中進行FIM分析。 制備(bei)15ml 1mg / mL BSA PBS溶(rong)液，渦流產生(sheng)(sheng)蛋白(bai)聚(ju)集(ji)物(wu)(wu)。 為了生(sheng)(sheng)成(cheng)蔗糖(tang)顆粒，將(jiang)含(han)有(you)(you)5% w/v蔗糖(tang)的(de)(de)25ml PBS加熱至(zhi)37°C恒(heng)定攪拌(ban)2小時，然后在室溫下(xia)孵育過(guo)夜。 將(jiang)大(da)腸桿菌(jun)(jun)(jun)培養物(wu)(wu)用(yong)PBS連續稀(xi)釋，獲得含(han)有(you)(you)不同(tong)濃度(du)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)細(xi)胞(bao)的(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。 從卡羅萊(lai)納(na)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)公(gong)司獲得的(de)(de)大(da)腸桿菌(jun)(jun)(jun)培養物(wu)(wu)用(yong)PBS稀(xi)釋為1:100，生(sheng)(sheng)成(cheng)含(han)有(you)(you)適當濃度(du)的(de)(de)用(yong)于FIM分析的(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。 然后將(jiang)這(zhe)種“儲備(bei)"溶(rong)液稀(xi)釋到(dao)(dao)1:2、1:4、1:8和(he)1:16，以(yi)得到(dao)(dao)含(han)有(you)(you)不同(tong)濃度(du)細(xi)菌(jun)(jun)(jun)的(de)(de)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)(pin)。
流動成像顯微鏡(FIM)：FlowCam 8100和(he)FlowCam Nano (Yokogawa Fluid Imaging Technologies; Scarborough, ME)用(yong)(yong)于(yu)分(fen)析前一節中描述的(de)(de)樣品的(de)(de)顆粒含(han)量。 使(shi)(shi)用(yong)(yong)VisualSpreadsheet®5.8軟(ruan)件對(dui)兩個(ge)FlowCam模型的(de)(de)所(suo)有(you)實驗進(jin)行儀器操作(zuo)和(he)數據分(fen)析。 兩種儀器都使(shi)(shi)用(yong)(yong)內置(zhi)的(de)(de)自動對(dui)焦(jiao)軟(ruan)件對(dui)聚苯乙(yi)烯乳膠校準珠(zhu)進(jin)行了聚焦(jiao)。FlowCam 8100單元使(shi)(shi)用(yong)(yong)15 μm微珠(zhu)進(jin)行聚焦(jiao)，而FlowCam納米(mi)單元使(shi)(shi)用(yong)(yong)700 nm微珠(zhu)進(jin)行聚焦(jiao)。 每個(ge)儀器中的(de)(de)流(liu)體(ti)在測量前用(yong)(yong)1%的(de)(de)Micro-90溶液清洗，然后在樣品之間用(yong)(yong)PBS清洗。
FlowCam 8100配備了10X物鏡、FOV80流(liu)單(dan)元和(he)單(dan)色相機(ji)。 以150 μL/min的流(liu)速(su)分析1ml樣品。 顆粒(li)檢測(ce)采用(yong)15個暗(an)像素和(he)15個亮像素閾值，4次(ci)閉孔(kong)迭代，距離(li)最(zui)近(jin)鄰4 μm進行分割。 本次(ci)分析使用(yong)的成像對(dui)象為直徑2-10 μm的物體。
FlowCam Nano配備了40X物(wu)(wu)鏡、60 μm流量單元和(he)灰度相機。250 μL樣(yang)(yang)品(pin)(pin)在25 μL/min流速下(xia)進行分(fen)析。 每(mei)(mei)個樣(yang)(yang)品(pin)(pin)采用相對計數方(fang)式進行分(fen)析。 蛋白質(zhi)聚集(ji)體和(he)蔗糖顆(ke)粒(li)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)采用20個暗像素(su)和(he)18個光(guang)像素(su)閾(yu)值，3次閉孔迭(die)代，距離最近鄰0.1 μm。 考慮到(dao)其(qi)更(geng)透明(ming)的顆(ke)粒(li)，大腸桿菌(jun)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)采用12光(guang)像素(su)閾(yu)值、4個封閉孔迭(die)代和(he)1 μm距離進行分(fen)割。 每(mei)(mei)個樣(yang)(yang)本類型還使(shi)用25的邊緣梯度濾波器來去除(chu)失焦或其(qi)他模糊的圖像。 在儀器尺寸范圍內的所有(you)其(qi)他檢測到(dao)的物(wu)(wu)體都用于此分(fen)析。
使用(yong)(yong)FlowCam Nano和FlowCam 8100對蛋白質(zhi)聚集體、蔗糖顆(ke)粒(li)和大(da)腸(chang)桿菌標本(ben)進行(xing)分析，以比較檢測到(dao)的顆(ke)粒(li)和兩種儀器報告(gao)的大(da)小(xiao)分布。 在每(mei)個(ge)儀器上(shang)對每(mei)個(ge)樣(yang)品進行(xing)三(san)個(ge)等(deng)分成像(xiang)。 當(dang)在一個(ge)單一的FlowCam模型(xing)上(shang)分析時，從每(mei)個(ge)樣(yang)本(ben)類型(xing)收(shou)集到(dao)的所有圖像(xiang)被匯集在一起，用(yong)(yong)于估計(ji)顆(ke)粒(li)大(da)小(xiao)分布，并為該(gai)樣(yang)本(ben)選(xuan)擇圖像(xiang)。
對含稀釋(shi)液大腸(chang)桿菌(jun)溶液的(de)(de)(de)樣(yang)品(pin)進(jin)行了分析(xi)(xi),以(yi)評估所檢測出(chu)顆粒濃(nong)度(du)(du)與樣(yang)品(pin)溶液實(shi)際濃(nong)度(du)(du)的(de)(de)(de)比例是(shi)線性的(de)(de)(de)。為了評估由于(yu)儀器和操(cao)作員導致(zhi)的(de)(de)(de)誤差(cha)，在(zai)前(qian)一節中列出(chu)的(de)(de)(de)稀釋(shi)劑的(de)(de)(de)大腸(chang)桿菌(jun)樣(yang)本(ben)被兩組(zu)不同的(de)(de)(de)分析(xi)(xi)人員分析(xi)(xi)。對每一組(zu)和每一組(zu)的(de)(de)(de)細菌(jun)細胞濃(nong)度(du)(du)進(jin)行檢測,實(shi)驗時加載(zai)400μL樣(yang)本(ben)進(jin)行了測試,并分析(xi)(xi)了其中的(de)(de)(de)300μL。然后(hou)通過(guo)線性回歸對產(chan)生的(de)(de)(de)稀釋(shi)-顆粒濃(nong)度(du)(du)數據(ju)進(jin)行了線性回歸的(de)(de)(de)分析(xi)(xi)。
結果與討論
FlowCam Nano和FlowCam 8100比較
在(zai)傳統的(de)(de)(de)(de)FIM儀(yi)器(FlowCam 8100)和(he)流式(shi)納米儀(yi)器上分析了(le)蛋白(bai)(bai)質(zhi)的(de)(de)(de)(de)聚(ju)集(ji)、蔗(zhe)糖顆(ke)粒(li)和(he)大(da)(da)腸(chang)桿(gan)菌細胞。圖(tu)3顯(xian)示了(le)每一(yi)個(ge)(ge)(ge)FlowCam 8100和(he)FlowCam Nano的(de)(de)(de)(de)每一(yi)個(ge)(ge)(ge)樣(yang)(yang)品(pin)(pin)的(de)(de)(de)(de)平均(jun)粒(li)徑分布(bu)。每一(yi)個(ge)(ge)(ge)樣(yang)(yang)本都有類(lei)似的(de)(de)(de)(de)粒(li)徑分布(bu)(圖(tu)3,右(you)柱);在(zai)一(yi)個(ge)(ge)(ge)特定的(de)(de)(de)(de)大(da)(da)小(xiao)(xiao)范圍(wei)內(nei),顆(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)濃度(du)隨著顆(ke)粒(li)粒(li)度(du)的(de)(de)(de)(de)減(jian)小(xiao)(xiao)而增(zeng)加,在(zai)每個(ge)(ge)(ge)樣(yang)(yang)本中(zhong)檢測(ce)到的(de)(de)(de)(de)物體的(de)(de)(de)(de)大(da)(da)部分都是存在(zai)于(yu)小(xiao)(xiao)粒(li)徑范圍(wei)內(nei)。這(zhe)(zhe)種不對(dui)稱的(de)(de)(de)(de)尺寸分布(bu)表明,每個(ge)(ge)(ge)樣(yang)(yang)本中(zhong)包含了(le)許(xu)多額(e)外的(de)(de)(de)(de)微粒(li), 并且對(dui)于(yu)小(xiao)(xiao)于(yu)2μm 的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)，FlowCam 8100已經接近檢測(ce)極限。用FlowCam Nano測(ce)量的(de)(de)(de)(de)三個(ge)(ge)(ge)樣(yang)(yang)本之間大(da)(da)小(xiao)(xiao)分布(bu)(圖(tu)3,左)。對(dui)于(yu)蛋白(bai)(bai)質(zhi)聚(ju)合體(圖(tu)3、上行)和(he)sucrose(圖(tu)3、中(zhong)行)樣(yang)(yang)本,FlowCam Nano展現的(de)(de)(de)(de)大(da)(da)小(xiao)(xiao)分布(bu)與FlowCam 8100具(ju)有相同的(de)(de)(de)(de)趨勢：這(zhe)(zhe)表明樣(yang)(yang)品(pin)(pin)中(zhong)小(xiao)(xiao)顆(ke)粒(li)占比更高。
對于(yu)這些樣本, FlowCam Nano檢測到(dao)樣本的(de)整(zheng)體(ti)顆粒含量比(bi)典(dian)型(xing)的(de)FIM儀器相對較大。根據這種表現，FlowCam Nano可以(yi)(yi)在它們產生早(zao)期時檢測蛋白質(zhi)聚(ju)集(ji)，以(yi)(yi)研(yan)究(jiu)降解路徑,然后再通過FlowCam 8100產生可以(yi)(yi)檢測到(dao)的(de)可見(jian)顆粒。
圖3:含有蛋白質聚合體(頂部排)、蔗糖顆粒(中行)和大腸桿菌細胞(底部排)的樣本的粒徑分布。使用FlowCam Nano(左)和FlowCam 8100(右)獲得尺寸分布。條形圖表明,在相應的大小箱中,每一種儀器捕獲的顆粒的分數。相應的線圖指示
與(yu)(yu)其他(ta)樣(yang)本不同(tong)的(de)(de)是,大(da)(da)腸(chang)桿(gan)菌(圖(tu)3,底(di)部排(pai))顯示了一個(ge)大(da)(da)小分(fen)布(bu),峰(feng)值在1到(dao)1.25μm之間(jian),大(da)(da)約是單個(ge)大(da)(da)腸(chang)桿(gan)菌細(xi)胞的(de)(de)大(da)(da)小。隨著(zhu)對顆粒被進(jin)一步確認,這些細(xi)胞的(de)(de)邊界比分(fen)布(bu)(圖(tu)4)顯示了0.2和0.3之間(jian)的(de)(de)峰(feng)值,與(yu)(yu)有機體(ti)的(de)(de)邊界比為0.25 (0.5 m厚,2個(ge)n長(chang))相(xiang)一致(zhi)。尺寸分(fen)布(bu)表明,在這個(ge)樣(yang)本中, 是FlowCam Nano檢測到(dao)了大(da)(da)腸(chang)桿(gan)菌細(xi)胞的(de)(de)比例(li)。
圖4:通過FlowCam Nano測量的大腸桿菌細胞的顆粒孔比。這個圖的格式與圖2中的大小分布相匹配。
圖5顯示了(le)兩種儀器的(de)三種顆(ke)(ke)(ke)粒(li)類型(xing)的(de)樣本圖像(xiang)。FlowCam 8100所檢(jian)測(ce)到的(de)小顆(ke)(ke)(ke)粒(li)通(tong)常表現出低(di)細(xi)節圖像(xiang),這使(shi)得區(qu)分(fen)不同的(de)形態是具有一(yi)定困難(nan)。相(xiang)比之(zhi)下,FlowCam Nano提(ti)供了(le)這些小顆(ke)(ke)(ke)粒(li)更詳(xiang)細(xi)的(de)圖像(xiang)。這些圖像(xiang)能夠使(shi)用戶(hu)(hu)很容易地將大腸桿菌的(de)圖像(xiang)與其(qi)他顆(ke)(ke)(ke)粒(li)類型(xing)區(qu)分(fen)開來,也可以幫(bang)助用戶(hu)(hu)區(qu)分(fen)蛋白質聚集和蔗糖(tang)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)。雖(sui)然(ran)細(xi)菌污染的(de)生(sheng)物樣本很難(nan)使(shi)用典型(xing)的(de)FIM圖像(xiang)來檢(jian)測(ce),但(dan)由于細(xi)菌圖像(xiang)和更常見(jian)的(de)蛋白制劑中顆(ke)(ke)(ke)粒(li)物圖像(xiang)的(de)鮮(xian)明對比,可以很簡單(dan)地對這兩類顆(ke)(ke)(ke)粒(li)進行區(qu)分(fen)。
圖5:FlowCam Nano(左列)和FlowCam 8100(右柱)蛋白質聚集(頂部排)、蔗糖顆粒(中行)和大腸桿菌細胞(底部排)的圖像。圖像與其他圖像的圖像近似。每一個顆粒的等效球面直徑值(μm)顯示在它們的圖像下面。
FlowCam Nano顆粒濃度一致性
在(zai)兩(liang)臺(tai)FlowCam Nano儀(yi)器上(shang)對稀釋的(de)大腸(chang)(chang)桿菌(jun)樣本(ben)進行了(le)額外的(de)實驗,以評估報(bao)告(gao)顆(ke)(ke)粒濃度(du)(du)(du)(du)的(de)相對精度(du)(du)(du)(du)。圖(tu)6顯(xian)示了(le)上(shang)述(shu)兩(liang)個(ge)組在(zai)不同(tong)稀釋的(de)大腸(chang)(chang)桿菌(jun)溶液中所(suo)報(bao)告(gao)的(de)顆(ke)(ke)粒濃度(du)(du)(du)(du)。雖然兩(liang)種(zhong)儀(yi)器的(de)絕 對濃度(du)(du)(du)(du)之(zhi)間存在(zai)一(yi)些差(cha)異,但兩(liang)種(zhong)儀(yi)器在(zai)樣本(ben)稀釋量和觀察(cha)到的(de)顆(ke)(ke)粒濃度(du)(du)(du)(du)之(zhi)間表(biao)(biao)現(xian)出很(hen)大的(de)線性度(du)(du)(du)(du),正如從(cong)線性回歸(gui)中獲(huo)得(de)的(de)高R2值所(suo)表(biao)(biao)明(ming)的(de)。這些結果(guo)表(biao)(biao)明(ming), FlowCam Nano能獲(huo)得(de)一(yi)致(zhi)的(de)顆(ke)(ke)粒濃度(du)(du)(du)(du),可(ke)以用來(lai)監測樣品中亞(ya)微米顆(ke)(ke)粒的(de)相對數量,以及它們的(de)大小和形狀。
圖6:對大腸桿菌樣本不同稀釋的顆粒濃度。每個圓圈和三角形都代表一個單一的FlowCam Nano的測量。線條代表了相應儀器的濃度數據的線性匹配。每個趨勢線的R2值顯示在每條線上。
結論
FlowCam Nano是(shi)(shi)一種極(ji)具(ju)價(jia)值的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)微米顆(ke)(ke)(ke)粒分析(xi)工具(ju),捕捉(zhuo)顆(ke)(ke)(ke)粒，分析(xi)大小(xiao)(xiao)和(he)類(lei)型信息(xi)(xi),擴展了(le)傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)FIM的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)典型測(ce)量范圍(wei)。此外(wai), FlowCam Nano提(ti)供(gong)了(le)與樣(yang)品顆(ke)(ke)(ke)粒含量一致的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒濃(nong)度(du)。這(zhe)些(xie)(xie)信息(xi)(xi)在分析(xi)蔗(zhe)糖、細(xi)菌細(xi)胞和(he)某些(xie)(xie)藥物(wu)(wu)輸送車輛(liang)等顆(ke)(ke)(ke)粒物(wu)(wu)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)性(xing)能(neng)方面是(shi)(shi)無(wu)價(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de),通常在傳(chuan)統的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)FIM的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)大小(xiao)(xiao)范圍(wei)內(nei)。在這(zhe)些(xie)(xie)較小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)物(wu)(wu)體(ti)上的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)信息(xi)(xi)也可能(neng)是(shi)(shi)有價(jia)值的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de),即(ji)使是(shi)(shi)在被發現的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒類(lei)型中(zhong),通常遇(yu)到的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒類(lei)型,如蛋白(bai)質聚(ju)(ju)(ju)集(ji),在一定程度(du)上是(shi)(shi)由(you)較小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒聚(ju)(ju)(ju)集(ji)而形成的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)。分析(xi)這(zhe)些(xie)(xie)小(xiao)(xiao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)亞(ya)微米蛋白(bai)聚(ju)(ju)(ju)集(ji)物(wu)(wu)可以幫助用(yong)戶識別這(zhe)些(xie)(xie)物(wu)(wu)體(ti),然后才能(neng)聚(ju)(ju)(ju)集(ji)和(he)形成更(geng)大的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒。
采用(yong)(yong)FlowCam Nano的(de)(de)(de)(de)亞(ya)微(wei)米顆(ke)(ke)粒(li)(li)特性補充了(le)其他(ta)分(fen)析技術。FlowCam Nano為用(yong)(yong)戶(hu)提供(gong)了(le)從(cong)其他(ta)儀(yi)器中無法(fa)獲得(de)的(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)(li)形態信息(xi),這(zhe)些信息(xi)可以(yi)用(yong)(yong)來確定樣本(ben)中的(de)(de)(de)(de)亞(ya)微(wei)米顆(ke)(ke)粒(li)(li)的(de)(de)(de)(de)類型。細(xi)菌細(xi)胞和(he)更(geng)常見的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物反(fan)應顆(ke)(ke)粒(li)(li)和(he)污染(ran)物。FlowCam Nano也(ye)可以(yi)用(yong)(yong)來擴(kuo)展從(cong)FlowCam 8100和(he)其他(ta)典型的(de)(de)(de)(de)FIM儀(yi)器提供(gong)的(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)(li)計數(shu)和(he)大小分(fen)布,這(zhe)能夠獲得(de)比任何一種單一儀(yi)器更(geng)大的(de)(de)(de)(de)檢測范圍。這(zhe)種結合的(de)(de)(de)(de)信息(xi)可以(yi)幫助用(yong)(yong)戶(hu)更(geng)好地了(le)解他(ta)們的(de)(de)(de)(de)生(sheng)物制(zhi)藥樣本(ben)中的(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)(li)含量,從(cong)而對產品質量做出更(geng)快、更(geng)準確的(de)(de)(de)(de)決定。
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