2020-07-01
蛋(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)穩定性指的(de)(de)是蛋(dan)白(bai)(bai)質抵(di)抗各種(zhong)因(yin)素的(de)(de)影響，保持其生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)活力(li)的(de)(de)能力(li)。蛋(dan)白(bai)(bai)質在細胞(bao)和(he)生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)體的(de)(de)生(sheng)(sheng)命活動過程中(zhong)，起著十分重要的(de)(de)作用(yong)。從生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)構(gou)(gou)成到生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)新陳代謝、遺傳都和(he)蛋(dan)白(bai)(bai)質的(de)(de)結構(gou)(gou)和(he)功能密(mi)切相關(guan)。生(sheng)(sheng)物(wu)(wu)的(de)(de)結構(gou)(gou)和(he)性狀(zhuang)都與蛋(dan)白(bai)(bai)質有關(guan)。因(yin)此，合(he)適的(de)(de)表征手段對(dui)研(yan)究(jiu)蛋(dan)白(bai)(bai)質變性至關(guan)重要。
一、蛋白質失活的原因和機理：
1蛋白水解酶和自溶作用
1.1酶在使用(yong)和貯存過(guo)程中的(de)失活常是由于(yu)微生(sheng)物(wu)和外源蛋白水(shui)解酶作用(yong)的(de)結果。蛋白水(shui)解酶可催(cui)化(hua)肽鍵水(shui)解。
1.2 當蛋(dan)白質底物也(ye)是一種蛋(dan)白水解酶時，就會發生自我降解現象，叫做自溶。
2 聚合作用
蛋白(bai)質發(fa)生可逆性(xing)伸(shen)展——>伸(shen)展的(de)(de)蛋白(bai)質分(fen)子(zi)彼(bi)此締合——>可能(neng)(neng)發(fa)生蛋白(bai)質分(fen)子(zi)間二硫(liu)鍵的(de)(de)形成從而使蛋白(bai)質沉(chen)淀(dian)析出。蛋白(bai)質的(de)(de)聚合作(zuo)用和沉(chen)淀(dian)的(de)(de)區別：蛋白(bai)質的(de)(de)聚合作(zuo)用可能(neng)(neng)是可逆的(de)(de)，并(bing)不一定(ding)是不可逆的(de)(de)。沉(chen)淀(dian)作(zuo)用意味(wei)著(zhu)(zhu)蛋白(bai)質并(bing)未發(fa)生顯著(zhu)(zhu)的(de)(de)構(gou)象變化即(ji)從溶(rong)液中析出。因(yin)此沉(chen)淀(dian)很容易再溶(rong)于(yu)水溶(rong)液宏，并(bing)恢復其(qi)全部天(tian)然特性(xing)。
3 pH
pH下引(yin)起(qi)(qi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)變(bian)性的(de)重要因素是(shi)：一旦(dan)遠(yuan)離了蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)等(deng)電點，那么蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)分(fen)子(zi)內(nei)相同(tong)電荷間(jian)的(de)靜電斥力(li)會導致蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)伸(shen)展。從(cong)而使埋藏在蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)內(nei)部非(fei)電離殘(can)基發(fa)生電離，導致失(shi)活。pH的(de)變(bian)化(hua)可(ke)以引(yin)起(qi)(qi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)(zhi)的(de)伸(shen)展，這(zhe)個過(guo)程原則(ze)上是(shi)可(ke)逆的(de)，但這(zhe)些變(bian)化(hua)常能導致不可(ke)逆的(de)聚合(he)或酶的(de)自(zi)溶，引(yin)起(qi)(qi)不可(ke)逆失(shi)活。
4 氧化作用
各種氧(yang)化劑能(neng)氧(yang)化帶芳香(xiang)族(zu)側鏈的氨(an)(an)(an)基(ji)(ji)酸(suan)以(yi)及蛋氨(an)(an)(an)酸(suan)、半胱氨(an)(an)(an)酸(suan)和(he)(he)胱氨(an)(an)(an)酸(suan)殘基(ji)(ji)，從(cong)而(er)使蛋白質變性。分(fen)子氧(yang)，H2O2和(he)(he)氧(yang)自由(you)基(ji)(ji)是常見的蛋白質氧(yang)化劑。
5 表面活性劑和去污劑
表面活性劑在很低(di)濃度下能使蛋(dan)白質發生(sheng)強(qiang)烈(lie)地相互作用，導(dao)致蛋(dan)白質不可逆變性。其中陰離(li)子去污劑的作用比陽離(li)子和非離(li)子去污劑強(qiang)烈(lie)。
6 變性劑
6.1脲(niao)和鹽酸胍：機(ji)制尚不(bu)明確，可能是(shi)消除了維持(chi)三(san)級結構的疏(shu)水作用力或直接(jie)與蛋白質分子作用
6.2高濃度鹽：高濃度鹽既(ji)有穩定作(zuo)用也有變性作(zuo)用，這(zhe)要看鹽的(de)性質和(he)濃度。
6.3螯(ao)合：常常不可(ke)逆(ni)地失活需(xu)(xu)要金屬(shu)輔(fu)(fu)因子(zi)的(de)酶(mei)，但可(ke)穩(wen)定不需(xu)(xu)要金屬(shu)輔(fu)(fu)因子(zi)的(de)酶(mei)。
6.4有機溶(rong)劑改變溶(rong)液的(de)介電常數；增(zeng)加疏水(shui)核(he)的(de)溶(rong)解(jie)度(du)，降低帶電表面的(de)溶(rong)解(jie)度(du)；奪去酶(mei)分子表面的(de)必須(xu)水(shui)而使酶(mei)失(shi)活(huo)。
7 重金屬離子和疏基試劑
與蛋白質的(de)疏基、二(er)硫(liu)鍵以及色氨酸(suan)、組氨酸(suan)殘(can)基反應。
8 熱
熱(re)失(shi)活(huo)是溶液上經常(chang)遇到的酶失(shi)活(huo)的原因。熱(re)失(shi)活(huo)分兩部分：伸展---不可逆失(shi)活(huo)。
9 機械力
振動(dong)、剪切、超聲(sheng)波、壓力(li)都可能引起(qi)蛋白質的變性(xing)。這種變性(xing)理論上是可逆的，但也伴隨(sui)著其他反應而不可逆地失活。
10 冷凍和脫水
冷(leng)凍和(he)脫(tuo)水(shui)時，溶質被濃縮，引(yin)起酶微環境中pH和(he)離子強度(du)的劇烈改(gai)變，減弱疏水(shui)相互作用，并(bing)可(ke)能引(yin)起二硫交換(huan)和(he)疏基(ji)的氧化。
11 輻射作用：
輻射可(ke)產生自由基（·OH,H2O2,O2-等）直(zhi)接(jie)(jie)或(huo)間接(jie)(jie)地作用于蛋白質分(fen)子。
二、蛋白質失活的研究方法
案例1 組氨酸對蛋白的保護作用
Turbiscan多重光(guang)散射(she)儀(yi)（靜態多重光(guang)散射(she)）
用Turbiscan多重光散(san)射儀測量(liang)高濃度蛋(dan)(dan)白溶液(ye)中的(de)(de)(de)平(ping)均粒徑(jing)來監(jian)測蛋(dan)(dan)白質的(de)(de)(de)聚集。該技術分(fen)析了(le)蛋(dan)(dan)白質的(de)(de)(de)自(zi)然(ran)形態與時(shi)間(jian)的(de)(de)(de)關(guan)系，且無(wu)需稀釋。10 wt%濃度的(de)(de)(de)牛血清白蛋(dan)(dan)白蛋(dan)(dan)白（BSA）分(fen)散(san)于水中，在60℃下分(fen)析20h。
蛋白粒徑(jing)與組(zu)氨酸(suan)含(han)量(liang)的關系（左：粒徑(jing)vs時間(jian) 右(you)：粒徑(jing)@20hvs組(zu)氨酸(suan)濃度(du)）
討論：增(zeng)加組氨酸濃度(du)可(ke)(ke)使(shi)蛋白直徑保持較(jiao)低(di)且更接(jie)近(jin)其原始狀態(tai)而(er)不發生變性。多(duo)重光散射(she)技(ji)術測量過程(cheng)無(wu)需(xu)稀(xi)釋，可(ke)(ke)以(yi)在原位狀態(tai)下表征蛋白質的聚集變性過程(cheng)，是比(bi)較(jiao)科學的研究(jiu)失(shi)穩過程(cheng)的方法(fa)。
案例2 輻射對蛋白質穩定性的影響
2018年Chengliang Li等學者(zhe)利用Turbscan(靜態多重光散射)研究了輻(fu)射對SP肌漿蛋(dan)白和MP肌肉(rou)蛋(dan)白的(de)物理穩定性(xing)的(de)影響。不(bu)同輻(fu)照(zhao)劑量0, 3, 5 and 7 kGy的(de)TSI不(bu)穩定性(xing)指數在(zai)3h內的(de)變化曲(qu)線如下圖所示。
TSI穩定性指數(shu)隨時間變化(hua)關系（左(zuo):MP肌(ji)(ji)肉蛋白 右：SP肌(ji)(ji)漿蛋白）
為了表(biao)征蛋白質失穩(wen)過程的(de)彈性(xing)和粘性(xing)性(xing)變化，Chengliang Li利用Rheolaser Master(動態多(duo)重光散(san)射(she))評價了不同輻射(she)劑(ji)量蛋白的(de)微流變性(xing)。
Rheolaser Master光學(xue)法微流變儀
微流(liu)變性(xing)隨時間變化關系（A MP肌(ji)(ji)肉(rou)蛋(dan)白(bai)彈性(xing) B SP肌(ji)(ji)漿蛋(dan)白(bai)彈性(xing) C MP肌(ji)(ji)肉(rou)蛋(dan)白(bai)粘性(xing) D SP肌(ji)(ji)漿蛋(dan)白(bai)粘性(xing)）
討論：對(dui)于MP肌肉(rou)蛋(dan)白(bai)而(er)言，輻(fu)射劑(ji)量(liang)≥5kgy時的(de)TSI高于輻(fu)射劑(ji)量(liang)3kgy的(de)TSI，但(dan)是差距不(bu)大，MP的(de)物理穩定性隨輻(fu)射劑(ji)量(liang)變化不(bu)明顯。這與微流變數據(A和C)有比較(jiao)好的(de)對(dui)應關(guan)系。另外(wai)，與SP對(dui)照(zhao)組相比，輻(fu)射后的(de)SP樣品的(de)TSI顯著升高，說明SP可能聚集并形(xing)成蛋(dan)白(bai)質(zhi)聚合物
Li C , He L , Ma S , et al. Effect of irradiation modification on conformation and gelation properties of pork myofibrillar and sarcoplasmic protein[J]. Food Hydrocolloids, 2018, 84(NOV.):181-192.
案例3 Rheolaser Crystal表征BSA蛋白的熱穩定性
Rheolaser Crystal相(xiang)變分析儀
熱(re)(re)分(fen)析(xi)是(shi)表(biao)征蛋白熱(re)(re)穩定性的(de)基本方(fang)法之一(yi)(yi)，多年以來一(yi)(yi)直(zhi)廣泛應用(yong)于科研和(he)工業中。近年來在各(ge)個領(ling)域，特別是(shi)高分(fen)子(zi)材料領(ling)域，都有(you)了長(chang)足發展(zhan)。差示掃描量熱(re)(re)法（DSC）是(shi)應用(yong)廣泛的(de)熱(re)(re)分(fen)析(xi)技術之一(yi)(yi)。相變分(fen)析(xi)儀(yi)(yi)（Rheolaser Crystal）與(yu)DSC應用(yong)方(fang)向(xiang)類似，可以表(biao)征蛋白質的(de)凝膠點，但(dan)是(shi)由于相變分(fen)析(xi)儀(yi)(yi)采用(yong)DWS技術，直(zhi)接從顆粒的(de)納米(mi)級(ji)運動速(su)度獲(huo)取數據，因此對(dui)于結構變化具有(you)更加靈敏的(de)相應。
蛋白受熱變性性示意圖
下圖展示了用(yong)Rheolaser Crystal與(yu)DSC測量的2%BSA pH 4, 15mM NaCl水溶液的凝膠點。
BSA蛋白的(de)在升溫(wen)過程中的(de)凝膠點（藍色：相(xiang)變分析(xi)儀(yi)數據(ju) 黑色：DSC數據(ju)）
討論：兩個(ge)測(ce)試(shi)技術的(de)凝膠(jiao)點(dian)基本一(yi)致。DSC由于(yu)基線并不(bu)(bu)(bu)平整，熱的(de)流(liu)量(liang)曲線在凝膠(jiao)點(dian)附近出(chu)現的(de)峰比較(jiao)小，容易(yi)被忽略。而Rheolaser Crystal的(de)峰非常清晰(xi)明了地(di)指示了BSA的(de)凝膠(jiao)點(dian)，由于(yu)測(ce)量(liang)方法的(de)優勢，Rheolaser Crystal不(bu)(bu)(bu)需要考慮樣品(pin)的(de)狀態固體，粉末，液體，對樣品(pin)制樣要求不(bu)(bu)(bu)高，樣品(pin)量(liang)多少對測(ce)試(shi)結果影響(xiang)不(bu)(bu)(bu)大(da)。
結論：多(duo)重(zhong)光(guang)散射技術(shu)是一種非常可靠(kao)的(de)表征蛋(dan)白(bai)質失穩(wen)過(guo)(guo)(guo)程(cheng)(cheng)的(de)儀器，采用(yong)靜態多(duo)重(zhong)光(guang)散射技術(shu)的(de)Turbiscan適合測量蛋(dan)白(bai)在原位狀(zhuang)態下的(de)粒徑(jing)/微觀結構變化過(guo)(guo)(guo)程(cheng)(cheng)；采用(yong)動態多(duo)重(zhong)光(guang)散射技術(shu)的(de)Rheolaser Master和Rheolaser Crystal分別用(yong)于表征蛋(dan)白(bai)變質過(guo)(guo)(guo)程(cheng)(cheng)中的(de)粘(zhan)彈性變化過(guo)(guo)(guo)程(cheng)(cheng)和蛋(dan)白(bai)熱穩(wen)定性。
結晶分析儀 Rheolaser Crystal
Rheolaser Crystal用于研(yan)究樣(yang)(yang)品(pin)微(wei)觀結構的(de)(de)轉(zhuan)變過程(cheng)，儀器基于先進的(de)(de)微(wei)流變學(xue)原(yuan)理對樣(yang)(yang)品(pin)進行熱力(li)學(xue)分析，監測所有(you)物理現象：結晶、融化(hua)(hua)、多(duo)晶形(xing)態轉(zhuan)變等(deng)。Rheolaser Crystal與(yu)Rheolaser Master類似，同(tong)樣(yang)(yang)采用DWS多(duo)散(san)斑(ban)(ban)擴散(san)光譜學(xue)。入射的(de)(de)激光被樣(yang)(yang)品(pin)中的(de)(de)顆粒(li)散(san)射，產(chan)生干涉，利用高速(su)攝像(xiang)(xiang)機捕捉散(san)斑(ban)(ban)圖像(xiang)(xiang)。散(san)斑(ban)(ban)圖像(xiang)(xiang)變換的(de)(de)速(su)度直接與(yu)顆粒(li)的(de)(de)運動速(su)度相關，顆粒(li)運動越快(kuai)，散(san)斑(ban)(ban)變化(hua)(hua)速(su)度越快(kuai)。
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