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概要

多劑量瓶(ping)(MDV)廣泛用于(yu)(yu)大(da)多數(shu)(shu)生物制藥(yao)，在(zai)(zai)(zai)使用前(qian)會被(bei)抽取(qu)到塑(su)料注射(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)。然而(er)，使用含(han)有硅油的(de)(de)(de)塑(su)料注射(she)器(qi)(qi)(qi)(SO注射(she)器(qi)(qi)(qi))處理治療性蛋(dan)白質時形成(cheng)的(de)(de)(de)可分解顆(ke)(ke)粒(li)可能存(cun)在(zai)(zai)(zai)問題。本研究旨在(zai)(zai)(zai)評估含(han)有人免疫(yi)球(qiu)蛋(dan)白(IgG)和(he)脂質納米顆(ke)(ke)粒(li)(LNPs)的(de)(de)(de)MDV重(zhong)新包(bao)裝注射(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)微(wei)粒(li)(>1 μm)形成(cheng)和(he)積累的(de)(de)(de)程度和(he)趨(qu)勢。采用光阻法(fa)(LO)和(he)流動成(cheng)像(FI)對微(wei)粒(li)進行分析。使用SO注射(she)器(qi)(qi)(qi)觀察到的(de)(de)(de)微(wei)粒(li)數(shu)(shu)量大(da)于(yu)(yu)不(bu)(bu)含(han)SO注射(she)器(qi)(qi)(qi)，并且微(wei)粒(li)數(shu)(shu)量隨著(zhu)兩種(zhong)藥(yao)物在(zai)(zai)(zai)注射(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)重(zhong)新包(bao)裝的(de)(de)(de)次數(shu)(shu)不(bu)(bu)斷增加(jia)。然而(er)，在(zai)(zai)(zai)不(bu)(bu)同(tong)品牌的(de)(de)(de)SO注射(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)觀察到很大(da)的(de)(de)(de)差異(yi)。相比之下，使用一種(zhong)不(bu)(bu)同(tong)的(de)(de)(de)技術從小瓶(ping)中(zhong)提取(qu)藥(yao)物顯著(zhu)減少(shao)了微(wei)粒(li)的(de)(de)(de)數(shu)(shu)量。此外(wai)，使用集成(cheng)過濾針或(huo)在(zai)(zai)(zai)配方(fang)中(zhong)加(jia)入穩定劑如(ru)乙酰精(jing)氨酸和(he)Tween 20也有助于(yu)(yu)減少(shao)顆(ke)(ke)粒(li)的(de)(de)(de)形成(cheng)。

一、簡介

多劑量瓶(ping)(mdv)比單劑量瓶(ping)(sdv)或預(yu)充注(zhu)射(she)器(qi)具有顯著的(de)(de)經濟和后勤優勢，特別是(shi)在大規模免(mian)疫(yi)規劃中。mdv是(shi)密封(feng)的(de)(de)容器(qi)，允許(xu)連續提取藥物部分而(er)不(bu)改變殘(can)留部分的(de)(de)質量，包(bao)(bao)括(kuo)純度(du)、濃度(du)和無菌。mdv被(bei)廣泛用(yong)于Covid- 19疫(yi)苗，包(bao)(bao)括(kuo)Moderna和輝瑞的(de)(de)疫(yi)苗。然(ran)而(er)，已經報道了一些使用(yong)注(zhu)射(she)器(qi)將(jiang)藥物從mdv中重新包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)(de)不(bu)良(liang)事(shi)件，如微(wei)(wei)生物污(wu)染、形成可(ke)(ke)見顆粒(li)和導致(zhi)免(mian)疫(yi)反(fan)應(ying)。一項(xiang)研究報道了使用(yong)mdv治(zhi)療聚乙二(er)醇肽可(ke)(ke)導致(zhi)過敏(min)(min)反(fan)應(ying)和死亡。對于可(ke)(ke)見微(wei)(wei)粒(li)，MDV批(pi)次中觀察(cha)到的(de)(de)微(wei)(wei)粒(li)數量(>1 μm)高于SDV批(pi)次，這表明(ming)過敏(min)(min)反(fan)應(ying)與MDV中微(wei)(wei)粒(li)的(de)(de)產生有關。

使用硅油(you)注射(she)(she)器(SO注射(she)(she)器)可(ke)增(zeng)加微粒(li)的(de)(de)生成已被廣泛研(yan)究。研(yan)究表明(ming)，由于(yu)硅油(you)的(de)(de)存在(zai)，亞可(ke)見顆(ke)粒(li)的(de)(de)形(xing)成增(zeng)加，而彈射(she)(she)或(huo)掉(diao)落注射(she)(she)器等機(ji)械應(ying)力進一步增(zeng)加了顆(ke)粒(li)的(de)(de)形(xing)成。硅油(you)誘導的(de)(de)微粒(li)可(ke)使患者發生免疫原性反應(ying)的(de)(de)風險較高(gao)。Chisholm等人(ren)(2016)的(de)(de)研(yan)究表明(ming)，蛋白(bai)質(zhi)吸附的(de)(de)硅油(you)微粒(li)破壞(huai)了對(dui)重(zhong)組蛋白(bai)的(de)(de)免疫耐受和抗體反應(ying)。其他幾(ji)項研(yan)究報(bao)告稱，在(zai)通過胰島(dao)素注射(she)(she)器進行玻(bo)(bo)璃(li)體內注射(she)(she)后，患者的(de)(de)玻(bo)(bo)璃(li)體腔中存在(zai)硅油(you)滴(或(huo)飛蚊癥)，這促使美國(guo)視(shi)網膜專家協(xie)會發布了關(guan)于(yu)胰島(dao)素注射(she)(she)器中硅油(you)滴的(de)(de)警(jing)報(bao)。預充注射(she)(she)器或(huo)針(zhen)管(guan)產品可(ke)以替代塑料注射(she)(she)器。然(ran)而，據報(bao)道，主因(yin)是(shi)(shi)在(zai)包(bao)裝(zhuang)從小瓶(ping)(ping)切換(huan)到預充注射(she)(she)器的(de)(de)情(qing)況下(xia)形(xing)成了蛋白(bai)質(zhi)聚集(ji)。說得更(geng)加具(ju)體的(de)(de)是(shi)(shi)蛋白(bai)質(zhi)暴露在(zai)某些產品中的(de)(de)硅油(you)中，否則在(zai)小瓶(ping)(ping)中可(ke)能(neng)不會遇到。

圖(tu)1所示(shi)。圖(tu)示(shi)演(yan)示(shi)了(le)從小瓶中提(ti)取藥(yao)物的常規逐步指(zhi)導(稱為(wei)“來回運動(dong)")

盡管有(you)關于(yu)SO注(zhu)射器(qi)不(bu)良反應的(de)報道，但在大(da)多數(shu)臨(lin)床(chuang)或(huo)非(fei)臨(lin)床(chuang)環境中沒有(you)采取緩解(jie)措(cuo)施。此外，MDV的(de)劑量(liang)大(da)小為(wei)每瓶(ping)(ping)2至20劑，大(da)多數(shu)兒童免疫接種為(wei)每瓶(ping)(ping)10或(huo)20劑，這(zhe)可能(neng)會增(zeng)加硅(gui)油從注(zhu)射器(qi)滲入到小瓶(ping)(ping)的(de)風險。一項(xiang)研(yan)究(jiu)報道，將貝伐珠單(dan)抗從小瓶(ping)(ping)重新包裝到SO注(zhu)射器(qi)中導致(zhi)藥(yao)物(wu)濃度(du)下降10%，微米(mi)級(ji)蛋白顆粒(>1 μm)大(da)幅(fu)增(zeng)加，隨后患者眼壓升高。另一項(xiang)來(lai)自復合藥(yao)房(fang)的(de)重新包裝貝伐珠單(dan)抗樣本的(de)研(yan)究(jiu)表(biao)明，硅(gui)油是(shi)顆粒數(shu)量(liang)增(zeng)加的(de)病(bing)原(yuan)體。因此，了(le)解(jie)與使用(yong)mdv和SO注(zhu)射器(qi)相關的(de)風險至關重要。

考(kao)慮到這些問題，本研究旨(zhi)在量化由于使用(yong)SO注(zhu)射器(qi)而在MDV中(zhong)形成的(de)(de)(de)(de)亞可見顆(ke)(ke)粒及其積累趨(qu)勢。我(wo)們模(mo)(mo)仿(fang)了(le)在臨床環境中(zhong)從小瓶中(zhong)取出藥物(wu)的(de)(de)(de)(de)技(ji)(ji)術(shu)，這些技(ji)(ji)術(shu)也在幾個指(zhi)南中(zhong)提供(圖1)。以(yi)肌內γ-球蛋白(IgG)和空脂質納米顆(ke)(ke)粒(LNPs)為(wei)模(mo)(mo)型藥物(wu)。每(mei)個小瓶中(zhong)的(de)(de)(de)(de)樣品被重(zhong)新包裝成8個不同品牌的(de)(de)(de)(de)注(zhu)射器(qi)，而只研究了(le)、第四、第七(qi)和第八支注(zhu)射器(qi)。光阻法(fa)(LO)測定(ding)顆(ke)(ke)粒數(shu)。雖然LO通常(chang)用(yong)于計算亞可見顆(ke)(ke)粒，但它不能(neng)計算半(ban)透明顆(ke)(ke)粒，并(bing)且可能(neng)錯誤(wu)標記(ji)顆(ke)(ke)粒大小。因此(ci)，將流式(shi)成像(xiang)(FI)技(ji)(ji)術(shu)與LO技(ji)(ji)術(shu)結合使用(yong)，以(yi)確定(ding)顆(ke)(ke)粒計數(shu)并(bing)區分顆(ke)(ke)粒的(de)(de)(de)(de)形態。通過FT-IR和評估(gu)其重(zhong)量差來確認硅油的(de)(de)(de)(de)存(cun)在。

二、材料與方法

2.1 材料和樣品制備

編號:020A19001, Gamma Globulin)，由(you)165 mg/mL人源IgG、22.5 mg/mL甘(gan)(gan)氨酸和(he)5mg /mL氯化鈉組(zu)成(cheng)，pH值(zhi)為6.8，購(gou)(gou)自GC Biopharma(京畿(ji)道，韓(han)(han)國(guo))。IgG用(yong)相(xiang)同的緩沖液(ye)稀釋至10 mg/mL, LNP在pH 7.4的緩沖液(ye)中(zhong)稀釋40倍(bei)。LNP載體(以下(xia)簡稱LNP)由(you)脂(zhi)質(zhi)膽固醇、peg2000神經(jing)酰胺、陽(yang)離子脂(zhi)質(zhi)和(he)1,2-二硬脂(zhi)酰- asn -甘(gan)(gan)油-3-磷(lin)酸膽堿(dsc)組(zu)成(cheng)，由(you)EnhancedBio Inc.(首(shou)(shou)爾，韓(han)(han)國(guo))提供。注射用(yong)水(WFI)購(gou)(gou)自JW制藥公司(si)(韓(han)(han)國(guo)首(shou)(shou)爾)，異(yi)丙(bing)醇(IPA)購(gou)(gou)自大田化學金屬有(you)限公司(si)(韓(han)(han)國(guo)京畿(ji)道)。n - α-乙酰- l-精氨酸和(he)Tween™20 Surfact-Amps™洗滌劑溶液(ye)(Tween 20)分(fen)別(bie)購(gou)(gou)自Sigma-Aldrich (St. Louis, LO, USA)和(he)Thermo Fisher Scientific (Cleveland, OH, USA)。

比較三種不同品牌的注射器:(1)kovax -注射器1 mL，可拆卸26號針頭(so -注射器1;韓國疫苗有限公司，京畿道，韓國)，(2)b1ml帶Luer-lok™尖端的注射器(so -注射器2;Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)和(3)HENKE-JECT^®兩部分一次性注射器1ml不含硅油(SO-free注射器)。所有的注射器都在有效期內使用過。KOVAX-NEEDLE 25G (25G針頭;除了“過濾器針頭測試"外，研究中所有3支注射器都使用了韓國疫苗有限公司(Korea Vaccine Co.，京畿道，Korea京畿道)，該測試使用了胰島素/結核菌素注射器(Ezfilter^®1ml, Donghwa C&M)的(de)可(ke)拆卸18號針(zhen)頭(tou)和5 μm針(zhen)頭(tou)過濾器。(首爾，韓國)。針(zhen)頭(tou)從原來的(de)注射(she)器中分(fen)離出(chu)來使(shi)用(yong)。對(dui)于MDV，使(shi)用(yong)高壓滅菌后的(de)5ml玻(bo)璃小(xiao)(xiao)瓶(ping)(BT134005, Hwankyung Tech, Seoul, Korea)，在(zai)重新包裝(zhuang)前用(yong)20mm橡膠塞和鋁(lv)壓蓋將(jiang)其封閉。對(dui)于再包裝(zhuang)注射(she)器，8支注射(she)器從5 mL裝(zhuang)藥的(de)小(xiao)(xiao)瓶(ping)中取出(chu)0.5 mL (n = 3)，第1、4、7、8支注射(she)器用(yong)于顆粒分(fen)析(xi)。

圖2所示。(a)研究中(zhong)使(shi)用的(de)代(dai)表性塑料注射器(qi)和針頭，(b)使(shi)用WFI和IPA從(cong)每(mei)種類型的(de)20支注射器(qi)中(zhong)提取(qu)的(de)干燥殘(can)留(liu)(liu)物的(de)重量，以及(ji)(c)從(cong)塑料注射器(qi)中(zhong)提取(qu)的(de)殘(can)留(liu)(liu)物的(de)疊加FT-IR光譜。

2.2 衰減全反射(she)FT-IR光譜

使用Nicolet iS5分(fen)光(guang)(guang)光(guang)(guang)度(du)計(Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)配備iD5鉆(zhan)石衰(shuai)減全反射(she)附(fu)件來鑒(jian)定(ding)硅油(you)。在(zai)室溫下測量紅外光(guang)(guang)譜(pu)。為(wei)了從注射(she)器(qi)中提(ti)取硅油(you)，每種型號各取50支注射(she)器(qi)，先充入(ru)0.5 mL的IPA，倒置10次(ci)，然(ran)后(hou)將(jiang)內容物釋放(fang)到50 mL的燒杯中。IPA在(zai)100°C下干燥，直到獲得恒定(ding)重(zhong)量。提(ti)取物用100 μL異丙(bing)醇重(zhong)溶。將(jiang)制備好的樣品取5 μL置于結(jie)晶板上干燥5min，在(zai)4000 cm??1 ~ 400 cm??1范圍(wei)內記錄64幅干涉圖，分(fen)辨率為(wei)4 cm??1。采用Nicolet Omnic軟(ruan)件8.2.387對樣品進(jin)行(xing)光(guang)(guang)譜(pu)分(fen)析(xi)。

2.3 硅(gui)油含量

為了測定(ding)塑(su)料注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)中(zhong)硅油(即可浸出的(de))的(de)相對含量，20支注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)各充入0.5 mL WFI和(he)IPA。填(tian)充后(hou)，注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)用注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)蓋密(mi)封并(bing)倒置10次，然后(hou)將內容物釋放到(dao)預稱(cheng)重(zhong)的(de)玻(bo)璃(li)小(xiao)瓶(ping)中(zhong)。將小(xiao)瓶(ping)中(zhong)的(de)溶劑在100℃下完全干(gan)燥，直到(dao)獲得(de)恒定(ding)重(zhong)量，并(bing)記(ji)錄干(gan)燥提(ti)取物的(de)重(zhong)量。

2.4 光阻法

使用HIAC 9703+液體粒子計數器(Beckman-Coulter, Brea, CA, USA)獲得顆粒濃度。在每次分析之前，用0.2 μm minusart^®NML無表(biao)面活性劑(ji)醋酸纖維素注射器(qi)(qi)過濾(lv)器(qi)(qi)(Sartorius AG, Goettingen，德國)過濾(lv)的(de)(de)去離子(zi)水(shui)沖洗流體(ti)路徑，然后測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)相同的(de)(de)顆(ke)粒計(ji)(ji)數(shu)以確認檢測(ce)(ce)(ce)(ce)器(qi)(qi)的(de)(de)清(qing)潔度。<10個(ge)粒子(zi)(p)/mL被(bei)認為是可接(jie)受的(de)(de)背景值。每(mei)個(ge)樣品測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)5次，每(mei)次測(ce)(ce)(ce)(ce)量(liang)體(ti)積(ji)為0.1 mL。使用3個(ge)結果的(de)(de)平均值(即刪除次和最后一次檢測(ce)(ce)(ce)(ce)的(de)(de)結果)來計(ji)(ji)算(suan)平均值和標準差(cha)。通過儀器(qi)(qi)自帶(dai)的(de)(de)PhamSpec軟件(版本為3.5.32)獲得粒徑>2 μm、>5 μm、>10 μm和>25 μm的(de)(de)顆(ke)粒。數(shu)據依次排列在2 ~ 10 μm、10 ~ 25 μm和>25 μm的(de)(de)尺寸范圍內。

2.5 流式成像法

采用(yong)配備10倍放大(da)鏡的(de)(de)Flowcam 8100 (Fluid-imaging Technologies, ME, USA)對(dui)顆粒(li)濃度(p/mL)及其形(xing)態進(jin)行分析。在每次(ci)樣品(pin)測量之前(qian)，測量去離子水以確認流(liu)體路(lu)徑和(he)流(liu)池(chi)的(de)(de)清潔度。顆粒(li)濃度< 50 p/mL被認為(wei)是(shi)可(ke)接受(shou)的(de)(de)背景值(zhi)(zhi)。在所有的(de)(de)測量中，使用(yong)未(wei)經稀釋的(de)(de)0.5 mL樣品(pin)溶(rong)液，以避免(mian)形(xing)成(cheng)的(de)(de)顆粒(li)解離(數(shu)據未(wei)顯示(shi))，0.1 mL的(de)(de)樣品(pin)溶(rong)液以0.1 mL/min的(de)(de)流(liu)速(su)測量5次(ci)。和(he)第(di)五(wu)項分析從數(shu)據收集中刪(shan)除。基于ABD的(de)(de)顆粒(li)粒(li)徑范圍為(wei)1 ~ 10 μm、10 ~ 25 μm和(he)>25 μm。通過3個(ge)(ge)連續測量和(he)3個(ge)(ge)單獨的(de)(de)小瓶計算平均值(zhi)(zhi)和(he)標準差。使用(yong)儀器自(zi)帶(dai)的(de)(de)VisualSpreadsheet軟(ruan)件(4.17.14版(ban)本)進(jin)行數(shu)據分析。

2.6 統計數據

實驗(yan)分三次進行(xing)，使用Excel程序計算平均(jun)值和標準(zhun)差。

2.7 統計分析

在Microsoft Excel中(zhong)使用(yong)Student’s t-test比(bi)較(jiao)LO和(he)(he)FI的(de)結果。每次分析的(de)統(tong)計學顯著性用(yong)單尾p值表(biao)示，p值分為<0.05(*)、&lt;0.01(**)和(he)(he)<0.001(***)三類。所有數據均以均值和(he)(he)標準差表(biao)示(n = 9)。

圖(tu)3所示。在WFI上通過(guo)LO(上)和FI(下)進行顆(ke)粒(li)分析，從小瓶(ping)中(zhong)來(lai)回移動(dong)重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)在塑料注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器中(zhong)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)的注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器中(zhong)顆(ke)粒(li)濃(nong)度與(yu)之前的注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器相(xiang)比增加有統(tong)計學(xue)意義(重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)的注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器#4 >重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)的注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器#1;重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)的注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器#7 >重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)的注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器#4;重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器#8 >重新包(bao)(bao)(bao)裝(zhuang)(zhuang)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器#7)

三、結果與討論

注射器內硅油含量

圖2a顯示了不同類型(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)含(han)硅油和不含(han)硅油的(de)(de)(de)(de)(de)注射(she)(she)器以及(ji)實驗中使(shi)用的(de)(de)(de)(de)(de)針頭。在之前的(de)(de)(de)(de)(de)研究中，我(wo)們使(shi)用IPA對SO注射(she)(she)器中的(de)(de)(de)(de)(de)硅油殘留物進行(xing)提取和定量。由(you)于(yu)大多數藥物配(pei)方都是基于(yu)水(shui)性溶劑，與IPA一起，WFI還用于(yu)相對量化塑料注射(she)(she)器的(de)(de)(de)(de)(de)可浸出水(shui)平(ping)。

圖2b顯示(shi)了(le)使用IPA和WFI從(cong)每種類型的(de)20支(zhi)注射(she)(she)(she)器(qi)中(zhong)提取(qu)的(de)干燥殘(can)(can)留(liu)物(wu)(wu)(wu)的(de)重量(liang)。由(you)于溶解度(du)的(de)差異(yi)，ipa提取(qu)殘(can)(can)留(liu)物(wu)(wu)(wu)的(de)數(shu)量(liang)可(ke)能更高。如圖所(suo)示(shi)，so -注射(she)(she)(she)器(qi)1產生的(de)殘(can)(can)留(liu)量(liang)最多(20支(zhi)注射(she)(she)(she)器(qi)的(de)平均值:WFI為(wei)(wei)1.20 mg, IPA為(wei)(wei)20.66 mg)，其次是so -注射(she)(she)(she)器(qi)2(20支(zhi)注射(she)(she)(she)器(qi)的(de)平均值:WFI為(wei)(wei)0.68 mg, IPA為(wei)(wei)5.27 mg)，這(zhe)表明不(bu)同(tong)供應商的(de)注射(she)(she)(she)器(qi)中(zhong)可(ke)浸出水平差異(yi)很大。進(jin)一步用傅里葉變換(huan)紅外(wai)光譜(pu)(FT-IR)對(dui)萃取(qu)物(wu)(wu)(wu)進(jin)行分(fen)析，以確(que)定(ding)殘(can)(can)留(liu)物(wu)(wu)(wu)中(zhong)存在(zai)(zai)(zai)硅油(you)。如圖2c所(suo)示(shi)的(de)FT-IR光譜(pu)顯示(shi)，硅油(you)在(zai)(zai)(zai)1260 cm??1 (CH3在(zai)(zai)(zai)Si-CH3中(zhong)的(de)彎(wan)曲振動(dong))、1090 cm??1、1020 cm??1 (Si-O-Si的(de)不(bu)對(dui)稱拉(la)(la)(la)伸(shen)振動(dong))和800 cm??1 (Si-C在(zai)(zai)(zai)Si-CH3中(zhong)的(de)拉(la)(la)(la)伸(shen)振動(dong))處(chu)有明顯的(de)吸收(shou)帶[31,32]。此外(wai)，FT-IR上的(de)吸光度(du)與殘(can)(can)留(liu)物(wu)(wu)(wu)的(de)數(shu)量(liang)相(xiang)關，如圖2c所(suo)示(shi)，進(jin)一步證實殘(can)(can)留(liu)物(wu)(wu)(wu)主要是硅油(you)。有趣的(de)是，盡管在(zai)(zai)(zai)FT-IR光譜(pu)中(zhong)沒有觀察到硅油(you)相(xiang)關的(de)峰，但(dan)在(zai)(zai)(zai)無so注射(she)(she)(she)器(qi)中(zhong)也發現了(le)少量(liang)殘(can)(can)留(liu)(WFI中(zhong)平均0.07 mg, IPA中(zhong)平均0.26 mg)。在(zai)(zai)(zai)這(zhe)種情況下，檢(jian)測到酰胺在(zai)(zai)(zai)3184和3375 cm??1處(chu)的(de)N-H拉(la)(la)(la)伸(shen)峰(數(shu)據未(wei)顯示(shi))和在(zai)(zai)(zai)1631和1557 cm??1處(chu)的(de)C - - 0拉(la)(la)(la)伸(shen)峰，表明無so注射(she)(she)(she)器(qi)提取(qu)物(wu)(wu)(wu)中(zhong)使用的(de)油(you)酰胺型潤滑劑(ji)存在(zai)(zai)(zai)。

so -注(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)1和so -注(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)2的(de)(de)硅(gui)油(you)每面積(ji)(ji)重(zhong)量(liang)(liang)分別為(wei)0.08 mg/cm2和0.02 mg/cm2，均(jun)在(zai)ISO 7886- 1:2017的(de)(de)一(yi)般限值(0.25 mg/cm2)內。相(xiang)比之下(xia)，使(shi)用可以完全溶(rong)解硅(gui)油(you)的(de)(de)乙酸乙酯(zhi)可以產(chan)生(sheng)更大的(de)(de)量(liang)(liang)。然而，我們(men)在(zai)本(ben)研究(jiu)中沒(mei)有使(shi)用有機溶(rong)劑，因為(wei)它(ta)也會提(ti)取雙酚A，并且(qie)會增加(jia)so -注(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)2中提(ti)取物(wu)(wu)的(de)(de)重(zhong)量(liang)(liang)。因此，即(ji)使(shi)是輕微的(de)(de)攪(jiao)拌，如傾斜注(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)幾次，也會導致硅(gui)油(you)從(cong)充滿WFI的(de)(de)注(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)釋放到MDV中。我們(men)進(jin)行了進(jin)一(yi)步的(de)(de)研究(jiu)，以評(ping)估有和沒(mei)有模(mo)型藥物(wu)(wu)的(de)(de)SO注(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)產(chan)生(sheng)的(de)(de)mdv中的(de)(de)顆(ke)粒(li)積(ji)(ji)累(lei)程度(du)。

圖(tu)4所(suo)示。10 mg/mL IgG，重新(xin)包裝(zhuang)在塑料注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)中(zhong)(a)， (b)無來(lai)回(hui)運動。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示重新(xin)包裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)中(zhong)顆(ke)粒濃度(du)與之(zhi)前的(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)相比增加有統計(ji)學(xue)意義(重新(xin)包裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)#4 >重新(xin)包裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)#1;重新(xin)包裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)#7 >重新(xin)包裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)#4;重新(xin)包裝(zhuang)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)#8 >重新(xin)包裝(zhuang)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)器(qi)(qi)(qi)(qi)#7)

再包(bao)裝注射(she)器中(zhong)WFI的(de)顆粒(li)分析

硅(gui)油(you)在注射(she)器(qi)(qi)內的(de)(de)釋放及(ji)其對生(sheng)物(wu)藥品穩定性和(he)有效性的(de)(de)影響以及(ji)免疫原性風險(xian)在過(guo)(guo)去20年中已經有報道(dao)。如(ru)圖1所(suo)示，將藥品取出的(de)(de)方法可(ke)能會增(zeng)(zeng)加污(wu)染瓶中剩(sheng)余藥品的(de)(de)風險(xian)。這將帶來更(geng)大的(de)(de)mdv風險(xian)，因為通過(guo)(guo)每(mei)次注射(she)器(qi)(qi)制(zhi)備(bei)引入小瓶的(de)(de)任(ren)何顆粒(li)(li)(li)都可(ke)能被攜帶到連續的(de)(de)注射(she)器(qi)(qi)上。為了(le)證(zheng)實顆粒(li)(li)(li)數(shu)量(liang)隨(sui)著注射(she)器(qi)(qi)制(zhi)備(bei)而增(zeng)(zeng)加的(de)(de)假設，最初進行了(le)預(yu)測試，將小瓶中的(de)(de)WFI重新(xin)包裝到8個帶硅(gui)油(you)和(he)不帶硅(gui)油(you)的(de)(de)注射(she)器(qi)(qi)中。然后使用LO和(he)FI評估注射(she)器(qi)(qi)的(de)(de)顆粒(li)(li)(li)計數(shu)。

圖3顯示了用(yong)LO和(he)(he)FI測定的(de)(de)瓶子(zi)中(zhong)再包(bao)裝注射(she)器中(zhong)WFI的(de)(de)顆(ke)粒(li)濃(nong)度(du)(p/mL)。結果(guo)表明，LO和(he)(he)FI的(de)(de)顆(ke)粒(li)濃(nong)度(du)相(xiang)差(cha)(cha)大于10倍。這種差(cha)(cha)異(yi)已(yi)被廣(guang)泛報(bao)道，并(bing)歸因于LO檢(jian)測光學對(dui)比度(du)低和(he)(he)/或折(zhe)射(she)率與(yu)介質相(xiang)似的(de)(de)顆(ke)粒(li)的(de)(de)能(neng)力有(you)限。與(yu)標(biao)準聚苯乙(yi)烯珠(折(zhe)射(she)率為(wei)1.6)不(bu)同，硅(gui)油(you)(1.405)和(he)(he)水(1.333)的(de)(de)折(zhe)射(she)率差(cha)(cha)異(yi)很小，可(ke)(ke)能(neng)限制了LO對(dui)硅(gui)油(you)顆(ke)粒(li)的(de)(de)檢(jian)測。然而(er)，LO和(he)(he)FI識(shi)別的(de)(de)顆(ke)粒(li)尺(chi)寸在(zai)1- 25 μm范圍(wei)內，在(zai)1-或2-10 μm范圍(wei)內顆(ke)粒(li)負荷較高。這一觀察結果(guo)與(yu)之前的(de)(de)一項研(yan)究一致，該研(yan)究報(bao)告在(zai)2-8?C下儲存90天后，注射(she)器中(zhong)1-10 μm范圍(wei)內產(chan)生(sheng)了更多的(de)(de)硅(gui)油(you)顆(ke)粒(li)。相(xiang)應的(de)(de)，LO檢(jian)測到的(de)(de)>25 μm的(de)(de)顆(ke)粒(li)數量可(ke)(ke)以忽略(lve)不(bu)計，而(er)FI沒有(you)檢(jian)測到這樣(yang)的(de)(de)顆(ke)粒(li)。

圖3顯示(shi)了(le)(le)(le)基于注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)類(lei)型的(de)(de)結(jie)果(guo)評價，可見(jian)so -注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)1的(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)(li)計(ji)(ji)數(shu)(shu)最高(gao)(gao)，其次是(shi)so -注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)2，與各自注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)的(de)(de)硅油(you)含(han)量(liang)(liang)相當(圖2b)。在無(wu)so注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)也檢測到(dao)顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)(li)，盡管(guan)相對較少(shao)。圖2c所示(shi)的(de)(de)FT-IR數(shu)(shu)據(ju)得到(dao)了(le)(le)(le)先前(qian)研究的(de)(de)證實，表(biao)(biao)明殘留物可能是(shi)從無(wu)so注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)的(de)(de)內(nei)表(biao)(biao)面釋放出來的(de)(de)油(you)酰胺。此外，從LO和FI獲得的(de)(de)數(shu)(shu)據(ju)顯示(shi)，無(wu)論注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)類(lei)型如何，隨(sui)著重(zhong)新包(bao)(bao)裝(zhuang)計(ji)(ji)數(shu)(shu)的(de)(de)增加(jia)，顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)(li)積(ji)累(lei)的(de)(de)模式相似。在所有類(lei)型的(de)(de)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)，顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)(li)濃度隨(sui)每次重(zhong)新包(bao)(bao)裝(zhuang)而增加(jia)，這支持(chi)了(le)(le)(le)我們(men)的(de)(de)假設。最初，在1 - 10 μm范圍(wei)內(nei)，重(zhong)新包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)(de)so -注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)1、so -注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)2和無(wu)so -注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)1中(zhong)的(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)(li)濃度(即按(an)FI計(ji)(ji)算)分別為1246 p/mL、1038 p/mL和874 p/mL，在重(zhong)新包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)(de)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)8中(zhong)分別增加(jia)到(dao)9830 p/mL、5744 p/mL和3458 p/mL。結(jie)果(guo)表(biao)(biao)明，高(gao)(gao)變異性的(de)(de)管(guan)理(li)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)和一個令人驚訝的(de)(de)結(jie)果(guo)，顆(ke)(ke)粒(li)(li)(li)(li)(li)濃度的(de)(de)增加(jia)取決于重(zhong)新包(bao)(bao)裝(zhuang)注(zhu)(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)(she)(she)(she)器(qi)(qi)(qi)的(de)(de)數(shu)(shu)量(liang)(liang)。

此(ci)外(wai)，每次重新包裝時顆(ke)(ke)粒濃(nong)度的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增(zeng)加也提出了在臨床環境中通常使用的(de)(de)(de)(de)(de)(de)提取(qu)技術(來回移(yi)動(dong))的(de)(de)(de)(de)(de)(de)問題(圖1)。從(cong)小瓶(ping)(ping)中提取(qu)藥(yao)品時經常會(hui)產生氣(qi)泡(pao)。在步(bu)驟(zou)4中，輕彈(dan)注(zhu)(zhu)射器使氣(qi)泡(pao)向注(zhu)(zhu)射器尖(jian)端移(yi)動(dong)會(hui)引起機械應力，從(cong)而導致(zhi)(zhi)硅油或其他潤滑(hua)劑從(cong)內桶中遷移(yi)[16]。此(ci)外(wai)，推動(dong)柱塞將(jiang)氣(qi)泡(pao)釋放(fang)到瓶(ping)(ping)中，將(jiang)釋放(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)潤滑(hua)劑引入瓶(ping)(ping)中。Melo等人的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究報道，輕彈(dan)注(zhu)(zhu)射器引起的(de)(de)(de)(de)(de)(de)SO液滴(di)水平升(sheng)高可能導致(zhi)(zhi)眼內注(zhu)(zhu)射患者不(bu)良反應增(zeng)加。圖3所示的(de)(de)(de)(de)(de)(de)結果表明(ming)，在含潤滑(hua)劑注(zhu)(zhu)射器中使用前(qian)后運(yun)動(dong)和輕彈(dan)會(hui)導致(zhi)(zhi)每次重新包裝時MDV中的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(可浸出)濃(nong)度增(zeng)加，這可能與藥(yao)物相(xiang)互作(zuo)用，影響藥(yao)物的(de)(de)(de)(de)(de)(de)療效和穩定(ding)性。

圖5所示(shi)。用(yong)FI對10 mg/mL IgG進(jin)行(xing)顆(ke)粒分析，重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)在(zai)塑料注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)中(a)， (b)沒有來回運動(dong)。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表(biao)示(shi)重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)中顆(ke)粒濃度與之前的(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)相比(bi)增加有統計學意義(重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)#4 >重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)#1;重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)#7 >重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)的(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)#4;重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)#8 >重新(xin)(xin)(xin)包(bao)(bao)裝(zhuang)注(zhu)(zhu)射(she)(she)(she)器(qi)#7)

再包(bao)裝注射器中(zhong)藥物(wu)顆粒分(fen)析(xi):前后運(yun)動的影響

我(wo)們以10 mg/mL IgG為模型藥物，考察硅(gui)油(you)(you)和(he)來(lai)回(hui)法對蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)治(zhi)療的(de)(de)(de)(de)(de)(de)影響(xiang)(xiang)。圖(tu)4和(he)圖(tu)5分(fen)(fen)(fen)別顯(xian)示了(le)(le)使用LO和(he)FI分(fen)(fen)(fen)析的(de)(de)(de)(de)(de)(de)再(zai)包(bao)(bao)裝注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)分(fen)(fen)(fen)析。當在(zai)(zai)(zai)(zai)小(xiao)瓶中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)存在(zai)(zai)(zai)(zai)IgG的(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下進行前后移(yi)動(dong)時，與(yu)(yu)WFI相(xiang)比(bi)，在(zai)(zai)(zai)(zai)所(suo)(suo)有(you)(you)尺寸范圍內都觀察到顆(ke)(ke)粒(li)濃度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顯(xian)著增加(jia)(jia)。在(zai)(zai)(zai)(zai)2個(ge)品牌(pai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)SO注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，每(mei)次重新包(bao)(bao)裝都有(you)(you)明(ming)(ming)顯(xian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)(jia)趨勢(shi)，表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)所(suo)(suo)產生的(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)積累和(he)轉移(yi)。與(yu)(yu)WFI樣品(圖(tu)3)相(xiang)比(bi)，重新包(bao)(bao)裝的(de)(de)(de)(de)(de)(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)#8中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，so -注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)1、so -注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)2和(he)無so -注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)計(ji)數分(fen)(fen)(fen)別比(bi)LO觀察的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)(jia)了(le)(le)5倍、6倍和(he)3倍(圖(tu)4a)，比(bi)FI觀察的(de)(de)(de)(de)(de)(de)增加(jia)(jia)了(le)(le)11倍、4倍和(he)3倍(圖(tu)5a)。結(jie)果表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)，與(yu)(yu)不(bu)使用SO的(de)(de)(de)(de)(de)(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)相(xiang)比(bi)，使用SO的(de)(de)(de)(de)(de)(de)注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)顆(ke)(ke)粒(li)濃度(du)(du)增加(jia)(jia)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)傾向更高，表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)硅(gui)油(you)(you)是(shi)(shi)顆(ke)(ke)粒(li)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)因(yin)。此(ci)(ci)(ci)外(wai)(wai)(wai)，還觀察了(le)(le)不(bu)同品牌(pai)SO注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)顆(ke)(ke)粒(li)濃度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)差(cha)異(yi)。造成(cheng)(cheng)(cheng)差(cha)異(yi)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)因(yin)可(ke)(ke)以解釋(shi)(shi)為從注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)硅(gui)油(you)(you)量(liang)不(bu)同(圖(tu)2b)，可(ke)(ke)能在(zai)(zai)(zai)(zai)使用so -注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)1時提供(gong)了(le)(le)更多(duo)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)膜和(he)顆(ke)(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)位點(dian)(圖(tu)3、4a和(he)5a)。然(ran)而，無論不(bu)同品牌(pai)，兩種SO注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)均存在(zai)(zai)(zai)(zai)>25 μm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)粒(li)，而在(zai)(zai)(zai)(zai)WFI中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)，這(zhe)(zhe)一(yi)(yi)差(cha)異(yi)不(bu)顯(xian)著。顆(ke)(ke)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)代表(biao)(biao)(biao)性(xing)FI圖(tu)像顯(xian)示，在(zai)(zai)(zai)(zai)IgG存在(zai)(zai)(zai)(zai)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)情況下，硅(gui)油(you)(you)與(yu)(yu)吸附的(de)(de)(de)(de)(de)(de)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)了(le)(le)一(yi)(yi)個(ge)復合(he)物，形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)了(le)(le)尺寸>25 μm的(de)(de)(de)(de)(de)(de)更大(da)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)亞可(ke)(ke)見顆(ke)(ke)粒(li)(圖(tu)6)。此(ci)(ci)(ci)外(wai)(wai)(wai)，藥物介質(zhi)對過程中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)微(wei)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)也有(you)(you)顯(xian)著影響(xiang)(xiang)。甘氨酸在(zai)(zai)(zai)(zai)本研(yan)究中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)作為IgG的(de)(de)(de)(de)(de)(de)賦形(xing)劑，通過減少界面(mian)(mian)吸附的(de)(de)(de)(de)(de)(de)有(you)(you)效(xiao)(xiao)性(xing)來(lai)增加(jia)(jia)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)分(fen)(fen)(fen)子(zi)展(zhan)開的(de)(de)(de)(de)(de)(de)能量(liang)，這(zhe)(zhe)可(ke)(ke)能是(shi)(shi)在(zai)(zai)(zai)(zai)SO存在(zai)(zai)(zai)(zai)下形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)微(wei)粒(li)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)主要途徑，使蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)分(fen)(fen)(fen)子(zi)容(rong)易(yi)被吸附到SO表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)。先前的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)，在(zai)(zai)(zai)(zai)注(zhu)(zhu)射(she)(she)筒處的(de)(de)(de)(de)(de)(de)硅(gui)油(you)(you)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)可(ke)(ke)以形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)層(ceng)。初級層(ceng)是(shi)(shi)不(bu)可(ke)(ke)逆(ni)結(jie)合(he)，而隨(sui)后的(de)(de)(de)(de)(de)(de)層(ceng)是(shi)(shi)可(ke)(ke)逆(ni)結(jie)合(he)，并且容(rong)易(yi)被柱塞頭的(de)(de)(de)(de)(de)(de)掃力解吸，釋(shi)(shi)放(fang)(fang)微(wei)粒(li)。此(ci)(ci)(ci)外(wai)(wai)(wai)，幾項攪拌研(yan)究表(biao)(biao)(biao)明(ming)(ming)，硅(gui)油(you)(you)顆(ke)(ke)粒(li)從注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)筒中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)釋(shi)(shi)放(fang)(fang)出來(lai)，為其表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)形(xing)成(cheng)(cheng)(cheng)蛋(dan)白(bai)(bai)(bai)質(zhi)膜提供(gong)了(le)(le)一(yi)(yi)個(ge)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)，并增加(jia)(jia)了(le)(le)顆(ke)(ke)粒(li)濃度(du)(du)。將注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)鍍(du)硅(gui)主要是(shi)(shi)為了(le)(le)減小(xiao)柱塞與(yu)(yu)筒體內表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)滑動(dong)力。由于硅(gui)油(you)(you)已(yi)被證明(ming)(ming)會(hui)增加(jia)(jia)注(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)微(wei)粒(li)濃度(du)(du)，具有(you)(you)等效(xiao)(xiao)斷裂損失(shi)和(he)滑動(dong)力的(de)(de)(de)(de)(de)(de)非硅(gui)化材料可(ke)(ke)能是(shi)(shi)緩解此(ci)(ci)(ci)類問題的(de)(de)(de)(de)(de)(de)替(ti)代品。

雖然用不(bu)含SO的(de)(de)(de)注射(she)器(qi)(qi)代替SO注射(she)器(qi)(qi)減(jian)少(shao)(shao)了顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)負荷，但顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)仍在生成，并且顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)濃(nong)度(du)隨著(zhu)(zhu)重(zhong)新(xin)包裝的(de)(de)(de)增加而增加的(de)(de)(de)趨勢持續(xu)存在，這意味著(zhu)(zhu)它們(men)與(yu)高蛋(dan)白濃(nong)度(du)的(de)(de)(de)產品不(bu)相容。進(jin)行了進(jin)一(yi)步(bu)的(de)(de)(de)調查(cha)，以(yi)確定不(bu)同的(de)(de)(de)提(ti)(ti)取技(ji)術是否(fou)可以(yi)防(fang)止(zhi)不(bu)可見顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)的(de)(de)(de)積累和(he)攜帶到(dao)連(lian)續(xu)的(de)(de)(de)注射(she)器(qi)(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)。在步(bu)驟(zou)4(圖1)中(zhong)(zhong)(zhong)輕彈注射(she)器(qi)(qi)使(shi)氣泡移動到(dao)噴嘴頂部后(hou)，注射(she)器(qi)(qi)從小(xiao)(xiao)瓶中(zhong)(zhong)(zhong)取出。然后(hou)，當推動柱(zhu)塞時，氣泡被釋(shi)放到(dao)空(kong)氣中(zhong)(zhong)(zhong)，直到(dao)藥(yao)物(wu)溶液(ye)暴露在針頭的(de)(de)(de)末端。然后(hou)將注射(she)器(qi)(qi)插入小(xiao)(xiao)瓶中(zhong)(zhong)(zhong)以(yi)調整所(suo)需的(de)(de)(de)藥(yao)物(wu)溶液(ye)體積。因此(ci)，在重(zhong)新(xin)包裝的(de)(de)(de)注射(she)器(qi)(qi)#8中(zhong)(zhong)(zhong)，觀(guan)察到(dao)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)計數顯著(zhu)(zhu)減(jian)少(shao)(shao)，分別(bie)由LO和(he)FI檢(jian)測到(dao)約2至4倍減(jian)少(shao)(shao)(圖4b)和(he)4至20倍減(jian)少(shao)(shao)(圖5b)。此(ci)外，當改變前(qian)后(hou)運動(圖4b)時，重(zhong)新(xin)包裝的(de)(de)(de)注射(she)器(qi)(qi)#8與(yu)無so注射(she)器(qi)(qi)(圖4a)之間的(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)濃(nong)度(du)差異(yi)(幾乎是10倍)最(zui)小(xiao)(xiao)(圖4a)。這一(yi)結果(guo)突出了指南中(zhong)(zhong)(zhong)提(ti)(ti)供的(de)(de)(de)提(ti)(ti)取技(ji)術和(he)防(fang)止(zhi)硅油顆(ke)(ke)(ke)粒(li)(li)(li)積聚方法(fa)的(de)(de)(de)缺點。

圖(tu)6所示。在10 mg/mL IgG中觀察(cha)到的顆粒的代表性FI圖(tu)像，重新包裝在含(han)有SO的塑料注射器中(右)，沒(mei)有來回運動(左)

此前(qian)已有研究報道(dao)硅(gui)油對(dui)蛋白(bai)質穩(wen)定性的(de)(de)(de)(de)影響。然而，其(qi)在(zai)用于(yu)核酸藥物(wu)遞送(song)的(de)(de)(de)(de)LNP制劑中的(de)(de)(de)(de)作用尚未研究。考(kao)慮到最(zui)近LNP配方的(de)(de)(de)(de)流行以及MDVs用于(yu)Covid-19疫(yi)苗，研究藥物(wu)穩(wen)定性的(de)(de)(de)(de)各個方面(mian)對(dui)于(yu)確保患者安全給藥至關重要。在(zai)LNP上使(shi)用相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)程序重復(fu)測試。然而，由(you)于(yu)FI結果似乎(hu)比LO更敏感，因(yin)此僅包(bao)括FI數(shu)據以供進一步討論(lun)。圖7a和b顯(xian)示(shi)了(le)使(shi)用FI分析的(de)(de)(de)(de)重新(xin)包(bao)裝LNP的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒濃(nong)度。在(zai)連(lian)續重新(xin)包(bao)裝的(de)(de)(de)(de)注(zhu)射(she)器(qi)中，顆(ke)粒濃(nong)度隨前(qian)后(hou)(hou)運動(dong)呈增(zeng)加趨(qu)勢(圖7a)。當避免前(qian)后(hou)(hou)運動(dong)(圖7b)時，顆(ke)粒計(ji)數(shu)沒有明顯(xian)增(zeng)加，不同類(lei)型注(zhu)射(she)器(qi)之間的(de)(de)(de)(de)差異較小(xiao)。

與(yu)(yu)硅油誘導(dao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)IgG顆(ke)(ke)(ke)粒積聚(ju)不同，在LNPs的(de)(de)(de)(de)(de)(de)代表性(xing)FI圖(tu)像中(zhong)(zhong)(zhong)區分(fen)硅油顆(ke)(ke)(ke)粒是(shi)具有挑(tiao)戰性(xing)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)(圖(tu)8)。通常，硅油顆(ke)(ke)(ke)粒是(shi)根據(ju)其圓形(xing)和中(zhong)(zhong)(zhong)空度與(yu)(yu)其他顆(ke)(ke)(ke)粒進行光學區分(fen)的(de)(de)(de)(de)(de)(de);硅油誘導(dao)顆(ke)(ke)(ke)粒的(de)(de)(de)(de)(de)(de)核(he)心更亮(liang)，核(he)心和邊緣(yuan)之間的(de)(de)(de)(de)(de)(de)對比(bi)度也(ye)很(hen)高(gao)。然而，LNP樣品中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)此類顆(ke)(ke)(ke)粒很(hen)少(shao)(圖(tu)8)。這(zhe)可(ke)(ke)以(yi)推測，因為LNP與(yu)(yu)SO相互作用或團聚(ju)產生(sheng)了(le)比(bi)蛋(dan)白質顆(ke)(ke)(ke)粒更致密、折射率更高(gao)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒。我們沒有進行進一步的(de)(de)(de)(de)(de)(de)表征，因為目前(qian)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)研(yan)究(jiu)旨在證明在給藥前(qian)，重新包裝(zhuang)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)標簽外使用SO注射器(qi)與(yu)(yu)多(duo)用途(tu)小瓶中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)藥物質量不同。同樣，在重新包裝(zhuang)過程中(zhong)(zhong)(zhong)盡量減(jian)少(shao)來回(hui)運動可(ke)(ke)以(yi)減(jian)少(shao)小瓶中(zhong)(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)(de)(de)顆(ke)(ke)(ke)粒積聚(ju)并(bing)攜(xie)帶到注射器(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)。

圖9所示。用FI對(a) 10mg /mL IgG進行顆粒分析，用過濾器集成針重新包裝在塑料注射器中(注射器中未使用過濾針的數據見圖3)，(b) 10mg /mL IgG加入添加劑后重新包裝在塑料注射器中，(c) LNP加入添加劑后重新包裝在塑料注射器中。所有樣品都被重新包裝，前后移動。*p < 0.05， **p < 0.01， ***p < 0.001表示帶濾芯針與不帶添加劑樣品的差異有統計學意義

過濾(lv)器集成(cheng)針在重新包裝中的影(ying)響(xiang)

美國(guo)衛(wei)生系(xi)統(tong)協會建議在(zai)使用(yong)單劑(ji)量安瓿時使用(yong)5 μm過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)集成(cheng)針(zhen)頭(tou)(tou)(tou)，以(yi)(yi)(yi)降(jiang)低(di)(di)將玻璃顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)到(dao)(dao)(dao)(dao)患者體(ti)內的(de)(de)(de)(de)風(feng)險。一(yi)些研(yan)究表明(ming)，集成(cheng)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)的(de)(de)(de)(de)針(zhen)頭(tou)(tou)(tou)可(ke)以(yi)(yi)(yi)有效地減少玻璃顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)污(wu)染。在(zai)線過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)也被用(yong)于靜(jing)脈輸液(ye)，以(yi)(yi)(yi)防止微顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)成(cheng)分(fen)進入血液(ye)循環[59]。在(zai)之前(qian)(qian)的(de)(de)(de)(de)一(yi)項研(yan)究中(zhong)(zhong)，與不使用(yong)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)的(de)(de)(de)(de)針(zhen)頭(tou)(tou)(tou)與SO注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)(qi)一(yi)起(qi)使用(yong)相(xiang)比，使用(yong)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)集成(cheng)針(zhen)頭(tou)(tou)(tou)可(ke)以(yi)(yi)(yi)降(jiang)低(di)(di)IgG制(zhi)劑(ji)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)濃(nong)度。在(zai)此基(ji)礎上，評價了5 μm過(guo)(guo)(guo)濾(lv)集成(cheng)針(zhen)對含IgG的(de)(de)(de)(de)mdv再(zai)包(bao)裝的(de)(de)(de)(de)效果(guo)。使用(yong)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)集成(cheng)針(zhen)降(jiang)低(di)(di)了所有粒(li)(li)(li)(li)徑(jing)范圍(wei)內的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)濃(nong)度(圖9a)。使用(yong)FI測(ce)定，重(zhong)新包(bao)裝的(de)(de)(de)(de)注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)(qi)#8中(zhong)(zhong)粒(li)(li)(li)(li)徑(jing)為1 - 10 μm的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)數量在(zai)so -注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)(qi)1中(zhong)(zhong)從(cong)111,414 p/mL減少到(dao)(dao)(dao)(dao)95,614 p/mL，在(zai)so -注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)(qi)2中(zhong)(zhong)從(cong)23,238 p/mL減少到(dao)(dao)(dao)(dao)15,524 p/mL。在(zai)粒(li)(li)(li)(li)徑(jing)> 10 μm范圍(wei)內，使用(yong)該(gai)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)可(ke)降(jiang)低(di)(di)顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)濃(nong)度。但粒(li)(li)(li)(li)徑(jing)>5 μm的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)仍存在(zai)，且(qie)其(qi)數量高(gao)于消除前(qian)(qian)后運動后的(de)(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)。這可(ke)能是(shi)由于硅(gui)油和/或(huo)誘導顆(ke)粒(li)(li)(li)(li)的(de)(de)(de)(de)靈活性(xing)，可(ke)以(yi)(yi)(yi)通(tong)過(guo)(guo)(guo)過(guo)(guo)(guo)濾(lv)膜;此外，在(zai)分(fen)析之前(qian)(qian)沒有更換過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)。然而，數據(ju)表明(ming)，過(guo)(guo)(guo)濾(lv)器(qi)(qi)(qi)集成(cheng)針(zhen)頭(tou)(tou)(tou)可(ke)以(yi)(yi)(yi)通(tong)過(guo)(guo)(guo)減少小瓶中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)積(ji)聚來降(jiang)低(di)(di)攜帶(dai)到(dao)(dao)(dao)(dao)連(lian)續注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)(qi)中(zhong)(zhong)的(de)(de)(de)(de)微粒(li)(li)(li)(li)水(shui)平，特別是(shi)在(zai)so注(zhu)(zhu)(zhu)射(she)(she)器(qi)(qi)(qi)2中(zhong)(zhong)。

吐溫20和乙(yi)酰精氨酸對(dui)再包裝的(de)影響

已知(zhi)非離子表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑，如(ru)聚山梨酯，可以降低單克隆抗體的界面(mian)(mian)(mian)應(ying)力(li)，從(cong)而最大限度(du)地減(jian)少硅油(you)(you)存在(zai)下的顆(ke)粒(li)(li)形成。表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑濃度(du)大于其(qi)臨界膠束濃度(du)(CMC)已被證明在(zai)將(jiang)蛋白(bai)質分(fen)子從(cong)界面(mian)(mian)(mian)上取代方面(mian)(mian)(mian)特別(bie)有(you)效[62]。然而，SO的存在(zai)進一步增加了蛋白(bai)質吸(xi)附的界面(mian)(mian)(mian)面(mian)(mian)(mian)積，因此需要使用更多的表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)活性劑來減(jian)少界面(mian)(mian)(mian)吸(xi)附。此外，150 mM的n - α-乙(yi)(yi)酰- l-精氨(an)酸(suan)(acetyl- l-arginine，乙(yi)(yi)酰精氨(an)酸(suan))被報道在(zai)硅油(you)(you)存在(zai)下抑制(zhi)(zhi)(zhi)攪拌應(ying)力(li)中(zhong)IgG的亞可見顆(ke)粒(li)(li)形成。因此，在(zai)本(ben)研究中(zhong)，在(zai)IgG和LNP中(zhong)加入(ru)10× 20和150 mM乙(yi)(yi)酰精氨(an)酸(suan)cmc，比(bi)(bi)較它們在(zai)重新(xin)(xin)包裝到SO注射器(qi)時(shi)減(jian)少顆(ke)粒(li)(li)形成的效果(guo)。當添加到IgG中(zhong)時(shi)，Tween 20和乙(yi)(yi)酰精氨(an)酸(suan)在(zai)所有(you)尺(chi)寸范(fan)圍內的顆(ke)粒(li)(li)濃度(du)都有(you)所降低(圖4a和5a與圖9b相(xiang)比(bi)(bi))。在(zai)SO注射器(qi)1中(zhong)，與重新(xin)(xin)包裝的注射器(qi)7相(xiang)比(bi)(bi)，顆(ke)粒(li)(li)濃度(du)的降低是(shi)顯著的，這表(biao)(biao)(biao)明在(zai)注射器(qi)制(zhi)(zhi)(zhi)備(bei)過程(cheng)中(zhong)，浸出硅油(you)(you)表(biao)(biao)(biao)面(mian)(mian)(mian)的蛋白(bai)質膜形成受到抑制(zhi)(zhi)(zhi)。

相(xiang)(xiang)比之(zhi)(zhi)(zhi)下，LO和FI結(jie)果表明(ming)(ming)，添(tian)加Tween 20后，1-10 μm的(de)(de)IgG顆粒(li)數(shu)量相(xiang)(xiang)對較多(duo)。大多(duo)數(shu)與硅油相(xiang)(xiang)關(guan)的(de)(de)顆粒(li)(在(zai)WFI中(zhong))的(de)(de)大小在(zai)1-10 μm之(zhi)(zhi)(zhi)間(圖2)。考(kao)慮到Tween 20由于(yu)其(qi)(qi)高(gao)濃(nong)度會影(ying)響(xiang)IgG的(de)(de)高(gao)階結(jie)構，它可能(neng)導(dao)致IgG的(de)(de)Fab區(qu)發生化(hua)學位移，而乙酰精氨(an)酸(suan)對其(qi)(qi)構象的(de)(de)影(ying)響(xiang)最(zui)小，只是阻止疏水(shui)相(xiang)(xiang)互作用(yong)，導(dao)致蛋白(bai)質(zhi)-蛋白(bai)質(zhi)相(xiang)(xiang)互作用(yong)減(jian)少(shao)(shao)。然而，與乙酰精氨(an)酸(suan)相(xiang)(xiang)比，Tween 20在(zai)> 10 μm的(de)(de)尺寸(cun)范圍(wei)(wei)內產生了更(geng)(geng)好的(de)(de)顆粒(li)還(huan)原效(xiao)(xiao)果，這表明(ming)(ming)Tween 20對空氣-水(shui)或其(qi)(qi)他(ta)界面應(ying)(ying)力的(de)(de)主要影(ying)響(xiang)，減(jian)少(shao)(shao)了更(geng)(geng)大顆粒(li)的(de)(de)形成。總體而言，與使(shi)用(yong)過(guo)濾器(qi)集成針頭相(xiang)(xiang)比，使(shi)用(yong)添(tian)加劑對重新包裝注射器(qi)中(zhong)硅油誘(you)導(dao)顆粒(li)的(de)(de)減(jian)少(shao)(shao)效(xiao)(xiao)果更(geng)(geng)好(圖9a與圖9b)。同樣，在(zai)重新包裝LNP時，Tween 20和乙酰精氨(an)酸(suan)也能(neng)有效(xiao)(xiao)地減(jian)少(shao)(shao)所有尺寸(cun)范圍(wei)(wei)內的(de)(de)顆粒(li)(圖9c)。因此，在(zai)將藥物投(tou)放市場之(zhi)(zhi)(zhi)前，還(huan)應(ying)(ying)考(kao)慮最(zui)大限度地減(jian)少(shao)(shao)超說明(ming)(ming)書使(shi)用(yong)注射器(qi)中(zhong)的(de)(de)顆粒(li)形成，并需要優化(hua)制備指南(nan)，以(yi)確(que)保給藥前的(de)(de)藥物質(zhi)量。

本研(yan)究(jiu)旨(zhi)在(zai)(zai)評估so注射(she)器(qi)重復使(shi)(shi)用MDV時顆粒(li)蓄(xu)積量。WFI、人源IgG和(he)LNP三種溶液的(de)(de)顆粒(li)水平均升高(gao)，尤其高(gao)于(yu)無(wu)so的(de)(de)注射(she)器(qi)。其濃(nong)度和(he)大(da)小(xiao)可能因(yin)生物(wu)藥品(pin)及其制劑的(de)(de)物(wu)理特(te)性而異。考慮(lv)到wfi填(tian)充的(de)(de)MDV中(zhong)顆粒(li)濃(nong)度呈持續(xu)增加的(de)(de)趨勢(圖3)，硅(gui)油(you)或微粒(li)的(de)(de)積累(lei)會對(dui)下一(yi)次重新(xin)包裝的(de)(de)注射(she)器(qi)產(chan)生影(ying)響。另一(yi)方面，本研(yan)究(jiu)的(de)(de)局限性在(zai)(zai)于(yu)只使(shi)(shi)用了LNP載體。因(yin)此(ci)，由于(yu)LNP與塑料注射(she)器(qi)中(zhong)硅(gui)油(you)的(de)(de)相互作(zuo)用可能與COVID-19疫苗等(deng)商業產(chan)品(pin)不(bu)同，因(yin)此(ci)沒有(you)進(jin)一(yi)步表征LNP與硅(gui)油(you)的(de)(de)相互作(zuo)用。然(ran)而，硅(gui)油(you)在(zai)(zai)MDV中(zhong)積累(lei)的(de)(de)影(ying)響絕不(bu)能被低估，例如，在(zai)(zai)使(shi)(shi)用低死(si)區注射(she)器(qi)(LDS)時，通過(guo)清(qing)除(chu)小(xiao)瓶中(zhong)的(de)(de)殘(can)留物(wu)來提供(gong)額外的(de)(de)劑量。

結論

本研究表明，每(mei)次連(lian)續注(zhu)射器從多用(yong)途(tu)小瓶(ping)中(zhong)提取硅(gui)油誘導的(de)亞可(ke)見顆(ke)粒(li)增加。改變停藥技(ji)術減少了微顆(ke)粒(li)的(de)數(shu)量，提示(shi)有(you)必要修改制備指南。此外，使用(yong)過濾器集成針或穩定劑也減少了顆(ke)粒(li)的(de)形成。顆(ke)粒(li)濃度可(ke)能與市場上的(de)“真正"藥品不同(tong)。然而，考慮到在生物(wu)制藥中(zhong)越來越多地使用(yong)耐多藥，認(ren)識(shi)到與亞可(ke)見顆(ke)粒(li)的(de)產(chan)生及其在小瓶(ping)中(zhong)的(de)積累有(you)關(guan)的(de)風險(xian)以(yi)及所使用(yong)的(de)材料(liao)類(lei)型和(he)技(ji)術的(de)影響至(zhi)關(guan)重要。