2022-05-19
摘要
目(mu)前還沒有(you)獲得美國(guo)(guo)食品和藥物管理局許可的(de)(de)預(yu)防埃(ai)博拉(la)病(bing)(bing)毒(EBOV)感染(ran)的(de)(de)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)。 目(mu)前正在(zai)開發的(de)(de)埃(ai)博拉(la)病(bing)(bing)毒候選(xuan)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)，以及(ji)目(mu)前大(da)多數獲得許可的(de)(de)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)，都(dou)需要在(zai)連續冷鏈(lian)下(xia)運輸(shu)和儲(chu)存(cun)，以防止產(chan)品效力(li)下(xia)降。 冷鏈(lian)需求在(zai)發展(zhan)中國(guo)(guo)家特(te)別難以滿足(zu)。 為了提(ti)高熱穩(wen)定(ding)性和降低(di)昂貴的(de)(de)冷鏈(lian)需求，使用凍(dong)干(gan)(gan)技術將一種對抗(kang)(kang)(kang)埃(ai)博拉(la)病(bing)(bing)毒的(de)(de)亞單位蛋白(bai)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)配(pei)制(zhi)(zhi)成玻璃(li)狀固體(ti)。 將添(tian)加微(wei)顆粒(li)氫氧化鋁的(de)(de)關鍵抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)——埃(ai)博拉(la)糖(tang)蛋白(bai)(EBOV-GP)配(pei)制(zhi)(zhi)成液體(ti)和凍(dong)干(gan)(gan)形式，并(bing)將疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)在(zai)40°C條(tiao)件下(xia)孵(fu)育(yu)12周(zhou)。 在(zai)12周(zhou)的(de)(de)潛伏期期間，在(zai)液體(ti)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)中觀(guan)察到EBOV-GP的(de)(de)聚集和降解，而在(zai)凍(dong)干(gan)(gan)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)中變化很小(xiao)。 在(zai)BALB/c小(xiao)鼠肌肉內(nei)三次免疫(yi)(yi)后(hou)，對EBOV-GP的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)反(fan)應(ying)測定(ding)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)的(de)(de)免疫(yi)(yi)原(yuan)性。 EBOV-GP制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)在(zai)液體(ti)和凍(dong)干(gan)(gan)形式中具有(you)同等的(de)(de)免疫(yi)(yi)原(yuan)性。 經(jing)過凍(dong)干(gan)(gan)和重(zhong)組，添(tian)加佐劑(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)在(zai)小(xiao)鼠體(ti)內(nei)產(chan)生的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)ebov - gp IgG抗(kang)(kang)(kang)體(ti)反(fan)應(ying)與相(xiang)應(ying)的(de)(de)添(tian)加佐劑(ji)(ji)(ji)(ji)的(de)(de)液體(ti)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)產(chan)生的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)反(fan)應(ying)相(xiang)似。 更重(zhong)要的(de)(de)是，注射40°C孵(fu)育(yu)12周(zhou)的(de)(de)重(zhong)組凍(dong)干(gan)(gan)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)制(zhi)(zhi)劑(ji)(ji)(ji)(ji)小(xiao)鼠的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)反(fan)應(ying)表(biao)明，高溫儲(chu)存(cun)后(hou)疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)的(de)(de)免疫(yi)(yi)原(yuan)性*保(bao)留，為未(wei)來疫(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)開發工(gong)作(zuo)提(ti)供(gong)了希望。
背景介紹
埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(EVD)是一(yi)(yi)種(zhong)致(zhi)命的(de)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)性疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)，最早于(yu)1976年(nian)在(zai)剛(gang)果民(min)主(zhu)共和(he)(he)國(guo)(guo)被報(bao)道(dao)。 過去(qu)50年(nian)來，埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)在(zai)多個非(fei)洲國(guo)(guo)家(jia)零星爆(bao)發(fa)。 最大(da)規模的(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)情是2014年(nian)至(zhi)2016年(nian)在(zai)塞拉(la)(la)利(li)昂(ang)、幾(ji)內(nei)亞(ya)(ya)和(he)(he)利(li)比(bi)里亞(ya)(ya)爆(bao)發(fa)的(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)情，期間共確診28616例(li)埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)，導(dao)致(zhi)11310人(ren)死亡。 目前(qian)還沒有獲得許可的(de)埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)。 因(yin)此，埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)是全世界研究工(gong)作的(de)主(zhu)題。 一(yi)(yi)些候(hou)選疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)在(zai)動物模型中(zhong)(zhong)(zhong)顯(xian)(xian)示(shi)出了希(xi)望，一(yi)(yi)些主(zhu)要(yao)(yao)通過病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)載體傳(chuan)播(bo)的(de)EBOV候(hou)選疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)的(de)人(ren)體臨床試驗(yan)結果已被報(bao)道(dao)。 從疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)的(de)制(zhi)造(zao)到(dao)運輸和(he)(he)儲存，必須控制(zhi)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)所(suo)暴露的(de)溫度(du)，通常都是在(zai)很窄的(de)范圍內(nei)，以保(bao)持其(qi)效力。 例(li)如，由默(mo)克(ke)公司(si)開(kai)發(fa)的(de)EBOV主(zhu)要(yao)(yao)候(hou)選疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)VSV-ZEBOV，在(zai)塞拉(la)(la)利(li)昂(ang)、幾(ji)內(nei)亞(ya)(ya)和(he)(he)利(li)比(bi)里亞(ya)(ya)進行了測試，目前(qian)用于(yu)剛(gang)果民(min)主(zhu)共和(he)(he)國(guo)(guo)正在(zai)爆(bao)發(fa)的(de)疫(yi)(yi)(yi)(yi)情，需(xu)要(yao)(yao)在(zai)- 60至(zhi)- 80°C之間持續儲存。 據(ju)報(bao)道(dao)，Janssen疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)公司(si)正在(zai)開(kai)發(fa)的(de)埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)Ad26-ZEBOV在(zai)40°C的(de)注(zhu)射(she)器(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)可穩定保(bao)存6小(xiao)時，但在(zai)25°C的(de)注(zhu)射(she)器(qi)中(zhong)(zhong)(zhong)保(bao)存3個月后，藥(yao)品的(de)效價(jia)受到(dao)“顯(xian)(xian)著影(ying)響(xiang)"。 在(zai)低收入和(he)(he)中(zhong)(zhong)(zhong)等收入國(guo)(guo)家(jia)，包括有埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)疫(yi)(yi)(yi)(yi)情歷(li)史的(de)國(guo)(guo)家(jia)，維持這些“冷(leng)鏈(lian)(lian)(lian)"需(xu)求成本高昂(ang)，尤(you)其(qi)困(kun)難。 此外，由于(yu)冷(leng)鏈(lian)(lian)(lian)的(de)要(yao)(yao)求，為未來疫(yi)(yi)(yi)(yi)情準備(bei)的(de)潛在(zai)庫存所(suo)需(xu)的(de)物流配置變得更加復雜。 因(yin)此，我們(men)需(xu)要(yao)(yao)一(yi)(yi)種(zhong)抗埃(ai)(ai)博(bo)(bo)拉(la)(la)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)毒(du)(du)疾(ji)病(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)(bing)的(de)耐熱疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)，這種(zhong)疫(yi)(yi)(yi)(yi)苗(miao)(miao)(miao)(miao)可以消除對連(lian)續冷(leng)鏈(lian)(lian)(lian)的(de)需(xu)求。
凍干法常用于穩(wen)定治療用蛋白(bai)(bai)制(zhi)劑。 在(zai)這個(ge)(ge)過(guo)程(cheng)中，首先將含有蛋白(bai)(bai)質(zhi)和玻璃化輔料(如(ru)海藻糖或蔗糖)的(de)(de)液體溶液冷凍，在(zai)冷凍濃(nong)縮輔料的(de)(de)玻璃狀基質(zhi)中形成(cheng)細小的(de)(de)冰晶(jing)懸浮液。 然后，在(zai)真空下(xia)通過(guo)升華(hua)去除冰，理想情況下(xia)留(liu)下(xia)一個(ge)(ge)固體的(de)(de)玻璃狀基質(zhi)，治療性蛋白(bai)(bai)被嵌入其中。 這種玻璃狀固體基質(zhi)中的(de)(de)分子運動(dong)受到高度限制(zhi)，這抑制(zhi)了需要大量分子運動(dong)的(de)(de)降解途徑，如(ru)蛋白(bai)(bai)質(zhi)聚集(ji)。 配方(fang)的(de)(de)凍干蛋白(bai)(bai)配方(fang)可以在(zai)較長時間內保持穩(wen)定(例如(ru)，至(zhi)少18-24個(ge)(ge)月)，甚至(zhi)在(zai)室溫下(xia)也可以。
為了使(shi)(shi)其具有足(zu)夠的(de)(de)(de)免疫(yi)原(yuan)性(xing)(xing)，基于亞單位(wei)蛋(dan)白(bai)抗原(yuan)的(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)通常需要(yao)添(tian)加(jia)(jia)佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)，如(ru)微(wei)顆(ke)粒(li)(li)氫氧化(hua)鋁懸(xuan)浮(fu)(fu)液。 這是一個挑(tiao)戰，因(yin)(yin)為這些疫(yi)苗(miao)的(de)(de)(de)配方(fang)必須保(bao)證足(zu)夠的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)，不僅(jin)對(dui)蛋(dan)白(bai)質(zhi)抗原(yuan)，而且對(dui)任何添(tian)加(jia)(jia)的(de)(de)(de)佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)。 佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)蛋(dan)白(bai)亞單位(wei)疫(yi)苗(miao)制劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)常規(gui)凍(dong)(dong)(dong)干是有問題(ti)的(de)(de)(de)，因(yin)(yin)為最初的(de)(de)(de)冷凍(dong)(dong)(dong)步驟可能會(hui)(hui)破(po)壞佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)懸(xuan)浮(fu)(fu)液的(de)(de)(de)穩(wen)定(ding)性(xing)(xing)。 用微(wei)粒(li)(li)佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)作(zuo)為佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)的(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)配方(fang)的(de)(de)(de)冷凍(dong)(dong)(dong)尤(you)其成問題(ti)，因(yin)(yin)為微(wei)粒(li)(li)懸(xuan)浮(fu)(fu)液的(de)(de)(de)冷凍(dong)(dong)(dong)會(hui)(hui)引起團聚(ju)(ju)并導致疫(yi)苗(miao)效力的(de)(de)(de)喪失。 在冷凍(dong)(dong)(dong)過程(cheng)中(zhong)，純(chun)冰(bing)晶(jing)體形成，濃縮(suo)佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)、抗原(yuan)和任何添(tian)加(jia)(jia)的(de)(de)(de)溶質(zhi)(如(ru)鹽和緩沖液)的(de)(de)(de)剩余懸(xuan)浮(fu)(fu)液，有時倍數(shu)為15-20倍或(huo)更多。 高濃度懸(xuan)浮(fu)(fu)的(de)(de)(de)佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)顆(ke)粒(li)(li)、高離(li)子強(qiang)度和潛在的(de)(de)(de)冷凍(dong)(dong)(dong)引起的(de)(de)(de)pH值變化(hua)的(de)(de)(de)結合會(hui)(hui)使(shi)(shi)佐(zuo)(zuo)劑(ji)(ji)懸(xuan)浮(fu)(fu)不穩(wen)定(ding)，導致不可接受的(de)(de)(de)顆(ke)粒(li)(li)團聚(ju)(ju)。
我們已經表明,freezing-induced擾動(dong)的(de)(de)(de)(de)氫(qing)氧(yang)化(hua)(hua)鋁懸(xuan)浮液(ye)可以(yi)最(zui)小化(hua)(hua)通過(guo)(guo)配(pei)方(fang)和凍(dong)(dong)干(gan)(gan)工藝條件(jian),降低(di)的(de)(de)(de)(de)程(cheng)(cheng)度(du)(du)freezing-induced濃(nong)(nong)度(du)(du)以(yi)及(ji)制定的(de)(de)(de)(de)時(shi)間(jian)花在(zai)(zai)冷(leng)凍(dong)(dong)濃(nong)(nong)縮液(ye)體狀態。 首先，我們將含有(you)(you)相對高濃(nong)(nong)度(du)(du)(如9.5 wt%)玻璃形成劑海(hai)藻糖的(de)(de)(de)(de)溶液(ye)凍(dong)(dong)干(gan)(gan)。 在(zai)(zai)凍(dong)(dong)結(jie)過(guo)(guo)程(cheng)(cheng)中，海(hai)藻糖最(zui)大濃(nong)(nong)縮到(dao)約76 wt%，因此9.5%的(de)(de)(de)(de)起始(shi)濃(nong)(nong)度(du)(du)限制了(le)(le)所有(you)(you)溶質可能(neng)的(de)(de)(de)(de)凍(dong)(dong)結(jie)濃(nong)(nong)度(du)(du)增(zeng)加約8倍(bei)。 其次，我們用醋酸銨作為(wei)緩沖(chong)液(ye)。 由于(yu)乙酸銨具有(you)(you)揮發性，在(zai)(zai)凍(dong)(dong)干(gan)(gan)過(guo)(guo)程(cheng)(cheng)中會蒸(zheng)發，進一步降低(di)了(le)(le)冷(leng)凍(dong)(dong)濃(nong)(nong)縮對離子強度(du)(du)的(de)(de)(de)(de)影響。 最(zui)后，通過(guo)(guo)使用預冷(leng)式冷(leng)凍(dong)(dong)干(gan)(gan)燥機(ji)貨架和快速冷(leng)凍(dong)(dong)干(gan)(gan)燥機(ji)貨架冷(leng)卻速度(du)(du)，我們限制了(le)(le)初始(shi)凍(dong)(dong)結(jie)和液(ye)體達到(dao)玻璃化(hua)(hua)轉(zhuan)變溫度(du)(du)之間(jian)的(de)(de)(de)(de)時(shi)間(jian)，從而最(zui)大限度(du)(du)地減少了(le)(le)由冷(leng)凍(dong)(dong)濃(nong)(nong)度(du)(du)引起的(de)(de)(de)(de)氫(qing)氧(yang)化(hua)(hua)鋁顆(ke)粒團(tuan)聚。
在本(ben)研究中(zhong)，我們應用(yong)了(le)這(zhe)些凍干配方(fang)(fang)和(he)加工策(ce)略，以減(jian)少在一種使用(yong)昆蟲細胞表達的(de)(de)(de)(de)EBOVGP作為抗(kang)原的(de)(de)(de)(de)耐(nai)高溫、氫氧化鋁佐劑(ji)亞單位蛋白疫(yi)苗(miao)中(zhong)凍干引起的(de)(de)(de)(de)氫氧化鋁團聚現象。 僅含(han)該抗(kang)原的(de)(de)(de)(de)疫(yi)苗(miao)配方(fang)(fang)對感染埃博拉病毒的(de)(de)(de)(de)小鼠(shu)模型具(ju)有保護(hu)(hu)作用(yong); 這(zhe)些保護(hu)(hu)性反應在含(han)有佐劑(ji)的(de)(de)(de)(de)配方(fang)(fang)中(zhong)增加。 為了(le)測(ce)試(shi)配方(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)熱穩定性，將疫(yi)苗(miao)在40°C孵育12周，并(bing)采用(yong)各種生(sheng)物物理技術進行表征。 用(yong)各種EBOV-GP疫(yi)苗(miao)配方(fang)(fang)肌內免疫(yi)BALB/c小鼠(shu)后產生(sheng)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)體反應來量化所測(ce)試(shi)疫(yi)苗(miao)配方(fang)(fang)的(de)(de)(de)(de)相對免疫(yi)原性。
材(cai)料
疫苗抗原EBOV-GP是在夏威夷大學生產的，如前所述。 氫氧化鋁佐劑(Alhydrogel®2%)來自Brenntag Biosector (Frederikssund，丹麥)。 考馬西®亮藍G-250購自MP Biomedicals LLC (Solon, Ohio)。 使用Bio-Rad實驗室(Hercules, CA)的PROTEAN®TGX™凝膠。 Anti-EBOV GP小鼠/人嵌合單克隆抗體(c13C6 FR1)購自IBT Bioservices (Gaithersburg, MD)，堿性磷酸酶Affini-純山羊抗人IgG, Fcγ片段特異性購自Jackson免疫研究實驗室(West Grove, PA)。 乙酸銨、三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸和磷酸鈉購自Sigma Aldrich(圣路易斯，MO)。 海藻糖來自Pfanstiehl, Inc. (Waukegan, IL)。 材料來自Thermo Fisher Scientific (Walthan, MA)，包括硫酸鈉，丙烯酰胺，硝基藍四唑(NBT)， 5-溴-4-氯-3-吲哚基磷酸鹽(BCIP)，注射用HyClone™水，10×磷酸鹽緩沖鹽溶液(10XPBS)，含1.37M氯化鈉，0.027M氯化鉀和0.19 m磷酸鹽。 FIOLAX®玻璃瓶(3ml)取自Schott(黎巴嫩，PA)。 丁基橡膠凍干塞(13毫米)購自Kimble Chase Life Science and Research Products, LLC (Vineland, NJ)，鋁密封件購自West Pharmaceutical Services, Inc. (Exton, PA)。 用于動物注射，非硅化HSW規范- ject®無菌1- mL注射器(Henke Sass Wolf, Tuttlingen，德國)和BD™25G 5/ 8英寸。 使用無菌針頭(Becton Dickinson and Company, Franklin Lakes, NJ, USA)。 黃花™動物柳葉刀(Medipoint Inc.， Mineola, NY)用于下頜下出血，血液收集在高壓釜1.7 mL聚丙烯管。
液體疫苗配方
疫苗配方由0.1 mg/mL EBOV-GP、10mM乙酸銨和9.5% (w/v)海藻糖組成，pH為7。 EBOV-GP在10mM乙酸銨中儲存在- 80°C，儲存濃度為1.3 mg/mL。 使用前，將EBOV-GP原液在室溫下解凍，以10000 g離心5分鐘，以去除凍結和解凍原液中可能存在的任何不溶性蛋白聚集物或其他顆粒。 將離心后的EBOV-GP原液上清液用含12% (w/v)海藻糖的10mM乙酸銨和足夠量的10mM乙酸銨稀釋，得到0.1 mg/mL EBOV-GP液體疫苗制劑的終濃度為10mM乙酸銨和9.5% (w/v)海藻糖。 一些疫苗配方中添加了微顆粒氫氧化鋁，Alhydrogel®。 在這些配方,2%的懸浮液Alhydrogel®(10毫克/毫升)抗原原液含有1.3毫克/毫升EBOV-GP在10毫米醋酸銨,12%海藻糖在10毫米醋酸銨的溶液,和足夠的10毫米醋酸銨被添加到1.6毫升聚丙烯離心管產量最終配方含0.1毫克/毫升EBOV-GP, 在9.5mM乙酸銨中添加0.5 mg/mL鋁和9.5%海藻糖。 在4°C的條件下，將這些配方端到端旋轉1小時，以使EBOV-GP吸附在氫氧化鋁顆粒上。 溶液用無菌水配制，用于制備緩沖液和蛋白制劑的容器用高壓滅菌器或購買的無菌設備滅菌。 2%的Alhydrogel®是無菌購買的，使用無菌技術從瓶子中取出等分。 對于未凍干的疫苗制劑，將1ml液體疫苗制劑配制成3ml玻璃瓶，加塞，并用鋁蓋密封。 在給藥之前，這些液體疫苗制劑在4°C保存，或在40°C孵育12周。
疫苗配方的凍干和重組
FTS系統LyoStar凍干機(Warminster, PA)用于疫苗制劑的冷凍干燥。 EBOV-GP制劑使用的配方賦形劑和凍干循環與Hassett等人使用的基本相同。將凍干機格架預冷至?10°C。 3毫升FIOLAX®玻璃小瓶(Schott，黎巴嫩，PA)裝滿了1毫升各種液體疫苗配方，小瓶的中間放置了小瓶塞子。 然后將小瓶放置在凍干機樣品室的預冷架子上。 為了盡量減少由于輻射和邊緣瓶效應而對單個瓶的熱傳遞的變化，裝有試驗疫苗配方的樣品瓶被裝滿水[34]的瓶子包圍。 在凍干循環的冷凍階段，凍干機的貨架溫度以0.5°C/min的速度下降到- 40°C，然后在- 40°C保持1小時，以確保瓶內內容物*冷凍。 將凍干機壓力降至8 Pa開始一次干燥，架子溫度以1°C/min的速度升高至?20°C，并保持20 h。 壓力持續控制在8 Pa同時二次干燥開始通過增加凍干機擱板溫度0°C的速度0.2°C /分鐘,其次是增加到30°C 0.5°C /分鐘,溫度5 h舉行。在周期的結束, 在凍干機中回充過濾后的氮氣，直至達到常壓狀態，在充滿氮氣的凍干室中，通過手動折疊凍干機架子將瓶塞從半程位置移動到*插入、密封的位置，自動密封小瓶。 密封的小瓶從凍干機中取出后，小瓶瓶塞用鋁蓋固定。 部分凍干疫苗在40°C保存12周; 未經過高溫儲存的凍干疫苗制劑在使用前保持在- 80°C。 在給小鼠使用之前，將凍干疫苗配方與所需的注射用水(WFI)進行重組，以獲得1.0 mL的總體積。重組疫苗配方輕輕混合，并在試驗前在實驗臺上放置至少30分鐘。 另一種疫苗配方包括一種重組的凍干疫苗配方，其中在凍干和重組后加入氫氧化鋁微粒。 該制劑在凍干制劑中加入注射用水，然后加入氫氧化鋁懸浮液，最終濃度為0.5 mg/mL氫氧化鋁，總體積為1.0 mL。 采用與含氫氧化鋁的液體配方相同的方法，將配方從小瓶轉移到1.6 mL的聚丙烯離心管中，并在4°C下端對端旋轉1小時，以使EBOVGP吸附在氫氧化鋁顆粒上，然后進行測試。
使用流式顆粒成像技術FlowCam®( Fluid Imaging Technologies, Scarborough, ME)獲得微米級范圍內的顆粒濃度和數字加權粒度分布。 在分析前對凍干配方進行重組，并在3個重復中進行測量。
在含有氫氧化鋁的配方的色譜圖中沒有檢測到可溶性蛋白，這表明基本上所有的EBOVGP都被吸附到顆粒上(數據未顯示)。 使用FlowCam®監測配方中的不溶性蛋白質和氫氧化鋁顆粒。 液體EBOV-GP、凍干EBOV-GP和重組EBOV-GP中氫氧化鋁顆粒的平均直徑分別為2.7±0.1 μm和4.7±0.1 μm。 ;這表明在凍干和/或重建過程中發生了一些氫氧化鋁的團聚。 然而，凍干和重組后的平均直徑遠低于報道的佐劑活性的上限10 μm。
注射液(ye)體(ti)(ti)形式(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)EBOV-GP疫(yi)(yi)苗(miao)制劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)鼠(shu)和注射重組(zu)凍(dong)干形式(shi)的(de)(de)(de)(de)(de)EBOV-GP疫(yi)(yi)苗(miao)制劑(ji)的(de)(de)(de)(de)(de)小(xiao)(xiao)鼠(shu)產(chan)生(sheng)了(le)類似(si)(si)的(de)(de)(de)(de)(de)針(zhen)對EBOV-GP的(de)(de)(de)(de)(de)IgG抗體(ti)(ti)反(fan)應(ying)(ying)，表明(ming)液(ye)體(ti)(ti)和凍(dong)干配(pei)方(fang)具有相同(tong)的(de)(de)(de)(de)(de)免疫(yi)(yi)原性。 此(ci)外，在(zai)重組(zu)和注射前在(zai)40°C孵(fu)育(yu)12周的(de)(de)(de)(de)(de)凍(dong)干疫(yi)(yi)苗(miao)配(pei)方(fang)小(xiao)(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)抗體(ti)(ti)應(ying)(ying)答與未(wei)孵(fu)育(yu)的(de)(de)(de)(de)(de)凍(dong)干疫(yi)(yi)苗(miao)配(pei)方(fang)小(xiao)(xiao)鼠(shu)的(de)(de)(de)(de)(de)應(ying)(ying)答相似(si)(si)。 因此(ci)，凍(dong)干EBOV-GP疫(yi)(yi)苗(miao)配(pei)方(fang)在(zai)接(jie)近埃博拉暴(bao)發地區最高(gao)環境(jing)溫度的(de)(de)(de)(de)(de)溫度下(xia)(xia)儲存12周后(hou)，免疫(yi)(yi)原性并不下(xia)(xia)降。
在(zai)40°C條(tiao)件(jian)下(xia)(xia)孵育(yu)12周后，液(ye)體(ti)(ti)制(zhi)劑(ji)中(zhong)EBOV-GP的(de)(de)(de)(de)聚集狀態(tai)發(fa)生(sheng)改變(bian)，而凍(dong)干制(zhi)劑(ji)中(zhong)只出(chu)現很小(xiao)的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)。 因此(ci)(ci)，我們預計(ji)液(ye)體(ti)(ti)制(zhi)劑(ji)在(zai)40°C孵育(yu)后免疫(yi)原(yuan)性會相應(ying)(ying)(ying)下(xia)(xia)降。 然而，在(zai)40°C下(xia)(xia)培養含鋁(lv)羥(qian)基佐劑(ji)的(de)(de)(de)(de)液(ye)體(ti)(ti)EBOV-GP配方(fang)12周并沒有(you)(you)降低(di)對(dui)EBOV-GP的(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)反(fan)應(ying)(ying)(ying)。 用(yong)構(gou)象(xiang)敏(min)感(gan)的(de)(de)(de)(de)c13C6抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)和(he)SE-HPLC進行(xing)Western blotting顯示，該制(zhi)劑(ji)中(zhong)EBOV-GP的(de)(de)(de)(de)組(zu)(zu)裝狀態(tai)發(fa)生(sheng)了變(bian)化(hua)，但抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)反(fan)應(ying)(ying)(ying)對(dui)這(zhe)種物理降解不敏(min)感(gan)。 構(gou)象(xiang)敏(min)感(gan)的(de)(de)(de)(de)c13C6抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)也(ye)與降解產(chan)物結合(he)，因此(ci)(ci)被認為(wei)是具有(you)(you)適當免疫(yi)原(yuan)性的(de)(de)(de)(de)關(guan)鍵抗(kang)(kang)(kang)原(yuan)表位似乎在(zai)降解的(de)(de)(de)(de)蛋白組(zu)(zu)分中(zhong)保留(liu)了下(xia)(xia)來。 這(zhe)與熒(ying)光猝滅結果一(yi)致，表明(ming)EBOV-GP保留(liu)了近(jin)天(tian)然的(de)(de)(de)(de)三(san)級結構(gou)。 注射了含氫氧化(hua)鋁(lv)的(de)(de)(de)(de)凍(dong)干疫(yi)苗的(de)(de)(de)(de)小(xiao)鼠在(zai)第(di)35天(tian)第(di)2次劑(ji)量后和(he)第(di)56天(tian)第(di)3次劑(ji)量后抗(kang)(kang)(kang)ebov - gp IgG MFI值相似。 對(dui)這(zhe)些(xie)結果的(de)(de)(de)(de)一(yi)種解釋(shi)可(ke)能是，在(zai)研(yan)究(jiu)中(zhong)使用(yong)的(de)(de)(de)(de)10 μg劑(ji)量時(shi)，免疫(yi)反(fan)應(ying)(ying)(ying)達到飽(bao)和(he)，因此(ci)(ci)只需要最初存在(zai)的(de)(de)(de)(de)一(yi)小(xiao)部分EBOV-GP就可(ke)以(yi)產(chan)生(sheng)顯著(zhu)的(de)(de)(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)體(ti)(ti)反(fan)應(ying)(ying)(ying)。
正(zheng)如預期的(de)(de)(de)(de)那樣，含(han)有常(chang)見疫(yi)(yi)苗佐劑(ji)氫氧化(hua)鋁(lv)的(de)(de)(de)(de)EBOV-GP疫(yi)(yi)苗配方比不(bu)(bu)含(han)佐劑(ji)的(de)(de)(de)(de)EBOV-GP疫(yi)(yi)苗配方更具有免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)。 冷(leng)凍(dong)通常(chang)會導致(zhi)氫氧化(hua)鋁(lv)顆粒(li)(li)(li)(li)聚(ju)集，在(zai)疫(yi)(yi)苗配方中(zhong)產生(sheng)直(zhi)徑可(ke)達(da)10-100 μm的(de)(de)(de)(de)顆粒(li)(li)(li)(li)。 這些冷(leng)凍(dong)誘(you)導的(de)(de)(de)(de)佐劑(ji)顆粒(li)(li)(li)(li)尺寸增加的(de)(de)(de)(de)影響仍(reng)然存在(zai)爭議。 冷(leng)凍(dong)可(ke)導致(zhi)疫(yi)(yi)苗失效。 一項(xiang)研究表(biao)明，鋁(lv)鹽佐劑(ji)顆粒(li)(li)(li)(li)在(zai)冷(leng)凍(dong)和干(gan)燥過程(cheng)中(zhong)的(de)(de)(de)(de)團聚(ju)是(shi)導致(zhi)這種(zhong)冷(leng)凍(dong)引(yin)起的(de)(de)(de)(de)免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)損失的(de)(de)(de)(de)原(yuan)(yuan)因，但在(zai)隨后(hou)的(de)(de)(de)(de)研究中(zhong)，檢查了(le)鋁(lv)鹽佐劑(ji)疫(yi)(yi)苗的(de)(de)(de)(de)凍(dong)融穩定性(xing)， 免(mian)疫(yi)(yi)反應并沒(mei)有因為(wei)冷(leng)凍(dong)引(yin)起佐劑(ji)粒(li)(li)(li)(li)徑分布的(de)(de)(de)(de)變(bian)化(hua)而改變(bian)。 無論(lun)冷(leng)凍(dong)誘(you)導的(de)(de)(de)(de)佐劑(ji)團聚(ju)是(shi)否會改變(bian)免(mian)疫(yi)(yi)原(yuan)(yuan)性(xing)，疫(yi)(yi)苗配方中(zhong)存在(zai)大(da)團聚(ju)不(bu)(bu)大(da)可(ke)能(neng)在(zai)藥學上是(shi)可(ke)接受(shou)的(de)(de)(de)(de)。
在本研究中，凍干后的顆粒平均直徑小于5 μm，可能是因為配方中9.5%海藻糖的存在抑制了團聚。 這些結果與Clausi等人的研究結果一致，他們發現高濃度的無定形成型輔料可以減少氫氧化鋁在凍干過程中的聚集。 此外，我們的研究發現，在稀釋液中凍干后加入氫氧化鋁的重組凍干疫苗配方注射小鼠的抗體反應與在凍干前加入氫氧化鋁的配方注射小鼠的抗體反應相同。 這表明，盡管添加了氫氧化鋁的EBOV疫苗配方在凍干循環過程中受到了冷凍，但冷凍引起的氫氧化鋁懸浮液的變化很小，不會影響疫苗的免疫原性。
開發穩定的(de)(de)(de)(de)凍(dong)干埃博拉疫苗配(pei)方(fang)可以大大減少冷鏈需(xu)(xu)求。 盡管我(wo)們測試的(de)(de)(de)(de)液(ye)(ye)體(ti)配(pei)方(fang)和凍(dong)干配(pei)方(fang)的(de)(de)(de)(de)免疫反應是相(xiang)同的(de)(de)(de)(de)，但在(zai)40°C條件下培養(yang)后在(zai)液(ye)(ye)體(ti)配(pei)方(fang)中觀察(cha)到的(de)(de)(de)(de)EBOV-GP蛋白的(de)(de)(de)(de)物理降(jiang)解可能會限制(zhi)液(ye)(ye)體(ti)配(pei)方(fang)在(zai)缺乏嚴格冷鏈要(yao)求的(de)(de)(de)(de)情況下的(de)(de)(de)(de)可接受(shou)性， 促進凍(dong)干制(zhi)劑(ji)的(de)(de)(de)(de)使用(yong)。 然而(er)，應該指出的(de)(de)(de)(de)是，凍(dong)干配(pei)方(fang)帶來了額(e)外(wai)的(de)(de)(de)(de)挑戰，如需(xu)(xu)要(yao)現場(chang)重組(zu)和需(xu)(xu)要(yao)單(dan)獨的(de)(de)(de)(de)稀釋劑(ji)瓶，這需(xu)(xu)要(yao)額(e)外(wai)的(de)(de)(de)(de)存儲空間，或雙筒注(zhu)射器內(nei)的(de)(de)(de)(de)凍(dong)干，這增加了成本。
總結
液(ye)體(ti)(ti)EBOVGP制劑在(zai)高(gao)溫(wen)(wen)孵(fu)育(yu)(yu)后，蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)(zu)裝狀(zhuang)態顯著降解，而凍(dong)干(gan)制劑的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)組(zu)(zu)裝狀(zhuang)態變(bian)化最小。 我們的(de)研究結(jie)果表明(ming)，與液(ye)體(ti)(ti)EBOV-GP配(pei)方(fang)相比，凍(dong)干(gan)不(bu)會降低疫(yi)(yi)苗在(zai)小鼠中的(de)免疫(yi)(yi)原性。 此外，注(zhu)射(she)重(zhong)組(zu)(zu)凍(dong)干(gan)疫(yi)(yi)苗配(pei)方(fang)(注(zhu)射(she)前在(zai)高(gao)溫(wen)(wen)下孵(fu)育(yu)(yu)12周)的(de)小鼠的(de)抗(kang)體(ti)(ti)反(fan)應(ying)與注(zhu)射(she)未在(zai)高(gao)溫(wen)(wen)下孵(fu)育(yu)(yu)的(de)重(zhong)組(zu)(zu)凍(dong)干(gan)疫(yi)(yi)苗配(pei)方(fang)的(de)小鼠的(de)抗(kang)體(ti)(ti)反(fan)應(ying)相似。 說明(ming)高(gao)溫(wen)(wen)貯存(cun)(cun)后疫(yi)(yi)苗免疫(yi)(yi)原性無(wu)損失(shi)。 凍(dong)干(gan)EBOV-GP疫(yi)(yi)苗配(pei)方(fang)具有耐熱(re)性，并有可能在(zai)分發和儲(chu)存(cun)(cun)期間消除對(dui)冷鏈的(de)需要。 有希望(wang)的(de)結(jie)果導致繼續研究EBOV GP和其他(ta)絲狀(zhuang)病毒候選疫(yi)(yi)苗的(de)熱(re)穩(wen)定性。
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