2020-04-16
單抗(kang)穩(wen)定性(xing)研(yan)(yan)究是(shi)貫穿于整個藥(yao)品(pin)(pin)(pin)研(yan)(yan)發、臨床試驗、藥(yao)品(pin)(pin)(pin)上市及上市后研(yan)(yan)究的(de)(de)(de)重要內容，是(shi)藥(yao)品(pin)(pin)(pin)儲(chu)存條件、有(you)效期(qi)等的(de)(de)(de)設(she)定依據，也是(shi)對產(chan)品(pin)(pin)(pin)生產(chan)工(gong)藝(yi)、制劑處方、包裝(zhuang)材料(liao)等的(de)(de)(de)適用(yong)性(xing)進行(xing)判斷(duan)的(de)(de)(de)參考(kao)，同時也是(shi)產(chan)品(pin)(pin)(pin)質(zhi)量(liang)標準制訂的(de)(de)(de)基礎。 在(zai)單抗(kang)穩(wen)定性(xing)研(yan)(yan)究中，單抗(kang)分子往往會發生聚(ju)集，形成由小而大(da)的(de)(de)(de)不同粒徑級別的(de)(de)(de)聚(ju)體(ti)(ti)，這些(xie)聚(ju)體(ti)(ti)是(shi)產(chan)品(pin)(pin)(pin)相(xiang)關(guan)雜質(zhi)，具(ju)有(you)潛(qian)在(zai)的(de)(de)(de)免疫(yi)原性(xing)。
SEC-HPLC可高效(xiao)、快(kuai)捷地檢測(ce)單(dan)抗藥物的(de)聚(ju)體含量，已廣泛用(yong)(yong)于(yu)單(dan)抗等生物制品(pin)的(de)質控分(fen)析(xi)， 但是使(shi)用(yong)(yong)這種方(fang)法往(wang)往(wang)面臨需(xu)要(yao)對樣品(pin)進行(xing)稀釋而(er)導致不(bu)穩(wen)定得(de)納米級蛋白(bai)聚(ju)集體發(fa)生解離，或(huo)者(zhe)微米級的(de)顆粒(li)在色(se)譜柱外或(huo)色(se)譜柱的(de)凝膠中被(bei)截留，無法通過該方(fang)法得(de)到(dao)有效(xiao)展示，又或(huo)者(zhe)由(you)于(yu)SEC-HPLC采用(yong)(yong)紫外檢測(ce)器，分(fen)辨(bian)率有限，使(shi)聚(ju)體得(de)不(bu)到(dao)有效(xiao)分(fen)離等問題(ti)。
FlowCam®（MDI，微流數字成像(xiang)法）可以(yi)反(fan)映樣品中微米級(ji)顆粒(li)(li)的(de)數量及粒(li)(li)度，并提供顆粒(li)(li)圖像(xiang)信(xin)息(xi)。通過專(zhuan)用軟件(jian)可以(yi)幫助使(shi)用者將(jiang)顆粒(li)(li)進行(xing)分(fen)類，輕松分(fen)辨出硅(gui)油，氣泡，蛋白質(zhi)聚集體，還是金(jin)屬，橡膠，玻璃(li)等脫卸物。
將兩種(zhong)方法合起來分(fen)析更有助于對穩定性研究中(zhong)樣品各粒徑級別蛋白聚體真實狀態(tai)的全面(mian)評估。
目的(de)：探討(tao)在單克隆抗體(ti)（單抗）穩定性研究中(zhong)，分子排阻高效液相色譜(pu)法（size exclusion-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）、微(wei)流數字成像（microflow digital imaging，MDI）技術、澄清度(du)及可見異物(wu)檢(jian)查在不同粒徑級別(bie)蛋白聚(ju)體(ti)監測中(zhong)的交互作用。
方(fang)法：分別采(cai)用(yong)SEC-HPLC、MDI、澄(cheng)清(qing)度及可見異物檢查研究腫瘤壞(huai)死因子α（TNFα）靶點(dian)單(dan)抗在4℃儲(chu)存6個(ge)月(yue)、37℃和(he)6000 lx 光照(zhao)條件下儲(chu)存28 d后，蛋白(bai)聚體、不溶性微(wei)粒、澄(cheng)清(qing)度及可見異物的(de)不同(tong)變化。
結果：SEC-HPLC結(jie)果表明，與(yu)樣品(pin)在4℃儲(chu)存6個月的(de)(de)結(jie)果相(xiang)比(bi)，抗(kang)(kang)(kang)TNFα單(dan)抗(kang)(kang)(kang)的(de)(de)蛋白聚體(ti)(ti)含量(liang)在37℃和6000 lx照(zhao)度(du)(du)(du)處理(li)28d后均(jun)增加均(jun)不(bu)明顯(xian)。使用MDI技(ji)術(shu)可(ke)(ke)見(jian)，抗(kang)(kang)(kang)TNFα單(dan)抗(kang)(kang)(kang)經37℃和6000 lx照(zhao)度(du)(du)(du)處理(li)28 d后，1～10 μm、10 μm以(yi)上(shang)、25 μm及以(yi)上(shang)粒徑的(de)(de)微粒數量(liang)比(bi)在4℃儲(chu)存6個月的(de)(de)樣品(pin)有明顯(xian)增多(duo)，且增多(duo)的(de)(de)微粒主要為蛋白聚體(ti)(ti)。通過目視法(fa)對樣品(pin)的(de)(de)澄清(qing)度(du)(du)(du)和可(ke)(ke)見(jian)異物檢查發現，37℃儲(chu)存和6000 lx照(zhao)度(du)(du)(du)處理(li)28 d后的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)TNFα單(dan)抗(kang)(kang)(kang)澄清(qing)度(du)(du)(du)低于(yu)4℃儲(chu)存的(de)(de)樣品(pin)；各儲(chu)存條件(jian)下的(de)(de)抗(kang)(kang)(kang)TNFα單(dan)抗(kang)(kang)(kang)均(jun)未(wei)檢出可(ke)(ke)見(jian)異物。
圖(tu) 1 三種儲(chu)存條件下抗 TN Fα 單(dan)抗的(de) SEC -H PLC 圖(tu)譜
討論(lun)：在單(dan)抗穩(wen)定性研(yan)究中(zhong)，納米(mi)級、微米(mi)級蛋(dan)白聚體的(de)(de)形成(cheng)上(shang)并不具有一(yi)致(zhi)性，因(yin)此，應采用多(duo)種方法(fa)對蛋(dan)白聚集情況進行(xing)表征和分析(xi)，避(bi)免單(dan)一(yi)方法(fa)的(de)(de)局限。
郭莎，張(zhang)峰等，中國食品(pin)藥品(pin)檢定研究院單(dan)克隆抗(kang)體產(chan)品(pin)室 衛生部(bu)生物技術產(chan)品(pin)檢定及標(biao)準(zhun)化重點實驗室，一(yi)種抗(kang) TN Fα 單(dan)抗(kang)不同粒(li)徑級別蛋白(bai)聚體監測結果的比較與(yu)評(ping)價(jia)，2018，32（8）：1073-1078
Fluid Imaging Technologies(FlowCam)公司成(cheng)立于1999年美國緬因州(zhou)斯卡伯勒市(shi)，其(qi)研(yan)發并生(sheng)產的(de)FlowCam系(xi)列(lie)儀(yi)器(qi)是將流(liu)式細胞法(fa)組合到數字成(cheng)像(xiang)顯微鏡中，基于圖像(xiang)分(fen)析(xi)法(fa)的(de)流(liu)式動(dong)態成(cheng)像(xiang)顆(ke)粒分(fen)析(xi)儀(yi)，它使顆(ke)粒分(fen)析(xi)變得更快，更簡(jian)單。具有革新意義的(de)FlowCam系(xi)列(lie)儀(yi)器(qi)被(bei)廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)于研(yan)發和質量控制(zhi)，應(ying)用(yong)涉(she)及(ji)多個領域(yu)。
FlowCam® 8100作(zuo)為MDI新型號已經替(ti)代文(wen)中(zhong)所提到的FlowCam® VS-1。新型號為生物制(zhi)藥(yao)行業作(zuo)出特別優化(hua)，具有以下先進性能：
小樣品需求量100μL
測量范圍：1~1,000μm
測(ce)樣率：100% （無檢測(ce)盲區）
成(cheng)像系統(tong)分辨(bian)率(lv)：單(dan)色1920X1220
進樣效率：50μL~5,000μL無極調速
快(kuai)門速度：高可達100幀/秒
大樣(yang)品濃度（@2.5μm）：5,000,000顆/毫升
顆粒圖像(xiang)顯示：顯示樣品所有顆粒圖像(xiang)
自動進(jin)(jin)樣(yang)器（選配）：具備加熱，冷卻，定軌搖床，紫外(wai)殺菌和(he)HEPA正壓過濾，大連續(xu)進(jin)(jin)樣(yang)量：2X96
校(xiao)準校(xiao)驗：使(shi)用NIST授(shou)權標準珠進行粒(li)度和(he)濃度檢(jian)測校(xiao)準校(xiao)驗
實(shi)驗結果：30+顆(ke)粒形態(tai)參數，直方圖，散點圖，TIFF格(ge)式顆(ke)粒圖像(xiang)，所有數據均可導入(ru)PDF和Excel文件
軟件合規性：滿足21CFR Part11
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