2020-03-27
單抗穩定性研究是貫穿于整個藥品研發、臨床試驗、藥品上市及上市后研究的重要內容，是藥品儲存條件、有效期等的設定依據，也是對產品生產工藝、制劑處方、包裝材料等的適用性進行判斷的參考，同時也是產品質量標準制訂的基礎。 在單抗穩定性研究中，單抗分子往往會發生聚集，形成由小而大的不同粒徑級別的聚體，這些聚體是產品相關雜質，具有潛在的免疫原性。
SEC-HPLC可高效(xiao)(xiao)、快(kuai)捷地檢(jian)(jian)測單(dan)抗(kang)藥物的(de)聚(ju)體(ti)含(han)量，已廣泛用(yong)于單(dan)抗(kang)等生物制品的(de)質控分(fen)析， 但是使用(yong)這種方(fang)法往(wang)往(wang)面臨需要對(dui)樣品進行稀釋而導致不穩(wen)定得納米(mi)(mi)級蛋(dan)白聚(ju)集體(ti)發生解離，或(huo)者微米(mi)(mi)級的(de)顆粒在色譜(pu)柱外(wai)或(huo)色譜(pu)柱的(de)凝(ning)膠中被(bei)截(jie)留，無法通過該方(fang)法得到(dao)有效(xiao)(xiao)展(zhan)示，又或(huo)者由于SEC-HPLC采用(yong)紫外(wai)檢(jian)(jian)測器，分(fen)辨率有限，使聚(ju)體(ti)得不到(dao)有效(xiao)(xiao)分(fen)離等問題。
FlowCam®（MDI，微流數字成像法）可以反映樣品中微米級顆粒的數量及粒度，并提供顆粒圖像信息。通過專用軟件可以幫助使用者將顆粒進行分類，輕松分辨出硅油，氣泡，蛋白質聚集體，還是金屬，橡膠，玻璃等脫卸物。
將兩種方法合起來分析更有助于對穩定性研究中樣品各粒徑級別蛋白聚體真實狀態的全面評估。
目的(de)：探(tan)討在單克(ke)隆(long)抗體（單抗）穩定性研究中(zhong)(zhong)，分子排阻(zu)高效液相色譜(pu)法(fa)（size exclusion-high performance liquid chromatography，SEC-HPLC）、微流數(shu)字成像（microflow digital imaging，MDI）技術、澄清度及可見異物(wu)檢查在不同粒徑級別蛋(dan)白聚(ju)體監測中(zhong)(zhong)的(de)交互作用。
方(fang)法：分別采(cai)用SEC-HPLC、MDI、澄清度(du)及(ji)可見(jian)異物(wu)檢(jian)查(cha)研(yan)究腫瘤壞死因子α（TNFα）靶點(dian)單抗在(zai)4℃儲存(cun)6個月(yue)、37℃和6000 lx 光照條件(jian)下儲存(cun)28 d后(hou)，蛋白聚體、不溶性微(wei)粒、澄清度(du)及(ji)可見(jian)異物(wu)的不同變化。
結果：SEC-HPLC結果表明，與樣品在4℃儲存6個月的結果相比，抗TNFα單抗的蛋白聚體含量在37℃和6000 lx照度處理28d后均增加均不明顯。使用MDI技術可見，抗TNFα單抗經37℃和6000 lx照度處理28 d后，1～10 μm、10 μm以上、25 μm及以上粒徑的微粒數量比在4℃儲存6個月的樣品有明顯增多，且增多的微粒主要為蛋白聚體。通過目視法對樣品的澄清度和可見異物檢查發現，37℃儲存和6000 lx照度處理28 d后的抗TNFα單抗澄清度低于4℃儲存的樣品；各儲存條件下的抗TNFα單抗均未檢出可見異物。
圖 1 三種儲存條件下抗 TN Fα 單抗的 SEC -H PLC 圖譜
討論：在單抗穩(wen)定性(xing)研究中，納米(mi)級、微米(mi)級蛋白(bai)聚(ju)體(ti)的形成上并不具有一(yi)致性(xing)，因此，應采用多種方法對蛋白(bai)聚(ju)集情況(kuang)進行表(biao)征和分析，避(bi)免單一(yi)方法的局限。
郭莎，張峰(feng)等，中(zhong)國食(shi)品藥品檢定研究院單(dan)克隆抗(kang)體產品室(shi)(shi) 衛生(sheng)部生(sheng)物技(ji)術產品檢定及(ji)標準化重點實驗(yan)室(shi)(shi)，一種抗(kang) TN Fα 單(dan)抗(kang)不同粒徑級別(bie)蛋白(bai)聚體監(jian)測結果的比(bi)較(jiao)與評價，2018，32（8）：1073-1078
Fluid Imaging Technologies(FlowCam)公司成立于1999年(nian)美(mei)國緬因州斯(si)卡伯勒市，其研發(fa)并生產的(de)(de)FlowCam系列(lie)儀器是(shi)將(jiang)流式(shi)(shi)細胞法(fa)組合到數字成像顯微鏡中，基于圖(tu)像分析(xi)法(fa)的(de)(de)流式(shi)(shi)動態成像顆(ke)粒(li)分析(xi)儀，它(ta)使顆(ke)粒(li)分析(xi)變得更(geng)快，更(geng)簡單。具(ju)有革新意(yi)義(yi)的(de)(de)FlowCam系列(lie)儀器被廣泛應用于研發(fa)和質(zhi)量控(kong)制，應用涉及多(duo)個領(ling)域(yu)。
FlowCam® 8100作為MDI新型號已經替代文中所提到的FlowCam® VS-1。新型號為生物制藥行業作出特別優化，具有以下先進性能：
小樣品需求量100μL
測量范圍：1~1,000μm
測(ce)樣(yang)率(lv)：100% （無檢(jian)測(ce)盲區）
成(cheng)像系統分辨率(lv)：單(dan)色(se)1920X1220
進樣效率：50μL~5,000μL無極(ji)調速(su)
快(kuai)門速(su)度：高可達100幀/秒
大樣品濃度（@2.5μm）：5,000,000顆(ke)/毫升
顆粒圖像(xiang)顯(xian)示：顯(xian)示樣品所(suo)有顆粒圖像(xiang)
自動進樣(yang)器（選配(pei)）：具備加(jia)熱，冷卻，定軌搖(yao)床，紫外殺(sha)菌和HEPA正壓過濾(lv)，大連續(xu)進樣(yang)量：2X96
校(xiao)準校(xiao)驗(yan)：使用NIST授權(quan)標準珠進行粒度和濃度檢測(ce)校(xiao)準校(xiao)驗(yan)
實驗結果：30+顆粒(li)(li)形(xing)態(tai)參數(shu)，直方圖(tu)，散點(dian)圖(tu)，TIFF格(ge)式顆粒(li)(li)圖(tu)像，所(suo)有數(shu)據均可導入PDF和Excel文件
軟件合規性：滿足21CFR Part11
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